千金藤素通过PI3K-AKT信号通路抑制前列腺癌细胞DU145增殖、侵袭和迁移①

梁泽旭 杨万山 董秀哲（延边大学附属医院，延吉 133000）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是全世界男性第二常见癌症，致死率排名第六，由于我国人口增长和老龄化，PCa发病率呈逐年上升状态［1］。早期PCa多通过手术治疗，而晚期或转移性PCa多采用雄激素剥夺疗法（androgen deprivation therapy,ADT）［2］。尽管ADT在最初治疗中有较好效果，但大部分患者会在3年内发展为去势抵抗型前列腺癌（castrationresistant prostate cancer，CRPC）［3］。而CRPC患者死亡的唯一因素就是转移［4］。因此，抑制PCa生长和转移在临床治疗上至关重要。千金藤素（cepharanthine，CEP）是一种从千金藤中提取的天然生物碱，因其在抗肿瘤及抗炎方面的药理作用被广泛关注［5］。如PAYON等［6］发现CEP可抑制卵巢癌细胞增殖；而KUDO等［7］发现CEP可通过抑制NF-κB信号通路发挥抗炎作用。尽管CEP已被证明在多种癌症中起抗癌作用，但其对PCa细胞增殖和侵袭迁移的影响尚不清楚。本研究拟探寻CEP是否通过调控PI3K-AKT信号通路影响PCa细胞增殖和转移。

1 材料与方法

1.1 材料 CEP购自索莱宝公司；E-cadherin（ab40772）、Vimentin（ab92547）和Snail（ab216347）抗体购自美国Abcam公司；PI3K（SRP0691）、p-PI3K（SAB4301553）、AKT（SAB4500797）、p-AKT（SAB43 01497）、GAPDH（SAB2108668）及 二 抗（A9044、A0545）购自Sigma公司；740Y-P购自Selleck公司；电泳仪、电泳槽、Western blot转膜仪和Gel Doc凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞存活率及药物浓度检测 采用CCK-8检测不同浓度CEP（0、5、10、20µmol/L）对DU145细胞存活率的影响，按照试剂盒说明书操作。

1.2.2 免疫荧光实验 将CEP处理后的DU145细胞接种于有盖玻片的6孔板，细胞80%融合时开始实验，加入一抗（1∶50）、二抗（1∶150）分别孵育2 h，DAPI封片，共聚焦显微镜拍照。

1.2.3 Western blot 细胞经CEP和或740Y-P处理后，收集并裂解，取30µg蛋白经电泳、转膜、封闭、抗体孵育后曝光成像，以GAPDH为内参，抗体稀释比例为E-cadherin（1∶1 500）、Vimentin（1∶1 500）、

Snail（1∶2 000）、PI3K（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000）、GAPDH

（1∶1 000）、二抗（1∶10 000）。

1.2.4 侵袭和迁移实验 将CEP处理的细胞和未处理细胞分为3组，分别加入带小室的24孔板，培养24 h后取出小室，甲醛固定，苏木素染色，封片，显微镜下拍照。小室外层铺基质胶后进行侵袭实验，步骤同上。

1.2.5 划痕实验 实验分组同迁移实验，制备密度为5×105个/ml的细胞悬液置于24孔板，待细胞贴壁后给予CEP处理，继续培养24 h，弃上清，改用无血清培养液培养4 h，20µl灭菌枪头做“一”字形划痕，PBS清洗，无血清培养液继续培养，0 h、48 h取样拍照。

1.2.6 网络药理学分析 通过PharmMapper平台（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper）对CEP的3D化学结构式进行靶点预测，将预测后的靶点导入DAVID数据平台（https：//david.ncifcrf.gov/）进行KEGG通路富集分析。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度CEP对DU145细胞增殖的影响 不同浓度CEP（0、5、10、20µmol/L，DMSO稀释）分别处理DU145细胞24 h，CCK-8测定生存率，与对照组相比，CEP≥10µmol/L时，DU145细胞增殖被抑制（P＜0.05），5µmol/L时对DU145细胞存活率无明显抑制作用（图1）。

图1 不同浓度CEP对细胞活力的影响Fig.1 Effect of different concentrations of CEP on cell viability

2.2 CEP对DU145细胞上皮-间充质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的影响 Western blot结果显示，DU145细胞经10、20µmol/L CEP处理后，与对照组相比，细胞内EMT标志物Vimentin和Snail蛋白表达明显下降，而E-cadherin蛋白表达升高（P＜0.05，图2A）。细胞免疫荧光结果与Western blot结果一致，Vimentin荧光强度随着药物浓度增加而减弱，E-cadherin荧光强度增强（P＜0.05，图2B）。

图2 CEP对DU145细胞EMT的影响Fig.2 Effect of CEPon EMT of DU145 cells

2.3 CEP对DU145细胞侵袭迁移的影响 侵袭迁移实验检测CEP对DU145细胞的影响，结果显示，与对照组相比，药物处理组细胞侵袭和迁移能力呈剂量依赖性减弱（P＜0.05，图3A）。划痕实验结果与侵袭迁移实验结果一致，细胞横向迁移指数呈剂量依赖性下降（P＜0.05，图3B）。

图3 CEP对DU145细胞侵袭迁移及横向迁移的影响Fig.3 Effect of CEP on invasion and migration of DU145 cells and wound healing

2.4 CEP对DU145细胞PI3K-AKT信号通路的影响 PharmMapper平台预测CEP潜在靶点共224个，对潜在靶点进行KEGG富集分析共得到125个结果，发现CEP不仅可对PCa产生影响，同时还有29个靶点作用于PI3K-AKT信号通路（表1）。Western blot结果显示，10、20µmol/L CEP处理DU145细胞24 h，胞内p-PI3K和p-AKT蛋白表达明显低于对照组（P＜0.05）且二者呈剂量依赖性（图4A）。采用PBS将740Y-P（PI3K-AKT信号通路激活剂）稀释至50µg/ml后联合CEP（10µmol/L）处理DU145细胞24 h，发现740Y-P能够逆转CEP对EMT相关蛋白的影响（P＜0.05，图4B）。

图4 CEP对DU145细胞PI3K-AKT信号通路的影响Fig.4 Effect of CEP on PI3K-AKT signal pathway in DU145 cells

表1 CEP的KEGG通路富集分析Tab.1 KEGG pathway enrichment analysis of CEP

3 讨论

PCa发病率在男性恶性肿瘤中位居第一，已成为男性健康的主要威胁［8-10］。当PCa进展为浸润性和转移性疾病时，患者五年生存率急剧下降［11］。目前，CEP已被证明可抑制多种癌症进展，如UNSON等［12］发现CEP可通过抑制P53突变抑制结直肠细胞生长。TANG等［13］发现CEP通过抑制自噬抑制非小细胞肺癌进展。但CEP在PCa中的作用尚未见报道。本研究表明，CEP（10、20µmol/L）能够显著抑制PCa细胞DU145增殖，且呈剂量依赖性。

研究表明，EMT在胚胎发育、伤口愈合、癌症转移和耐药性中具有关键作用［14-15］。经历EMT的细胞从极化上皮表型转变为高度可移动的间充质表型，该表型可增强癌细胞侵袭和迁移能力［15］。因此，抑制PCa细胞EMT进程可作为转移性PCa的潜在治疗方法。本研究显示，CEP（10、20µmol/L）处理后，DU145细胞EMT相关蛋白（Vimentin、Snail和E-cadherin）表达受到影响，同时细胞侵袭和迁移能力被明显抑制，表明CEP不仅可抑制PCa细胞DU145增殖，同时可抑制其转移。

PI3K-AKT信号通路是癌症的经典通路之一，不仅参与癌细胞增殖，同时调控癌症干细胞样特性及EMT［16］。LI等［17］研究证实，淫羊藿苷Ⅱ通过抑制PI3K-AKT信号通路降低PCa细胞EMT和转移能力。已有研究证实CEP通过下调p-AKT表达抑制肝癌细胞增殖［18］。本研究通过网络药理学结合实验验证的方法证实在DU145细胞中，CEP具有调控PI3K-AKT信号通路的能力，且PI3K-AKT信号通路激活剂可逆转CEP对DU145细胞EMT的影响。

综上，CEP可能通过调控PI3K-AKT信号通路影响PCa细胞DU145增殖、EMT、侵袭和迁移，为临床应用CEP治疗PCa提供了实验基础。