RNA结合基序蛋白家族介导的可变剪接在心肌疾病中的研究进展

刘 述，丁 虹，赵可心，白 锋，张小卫*

(1.兰州大学第二医院 心血管内科； 2.兰州大学 第二临床医学院； 甘肃 兰州 730030)

RNA剪接是从前体RNA分子中去除内含子并将外显子连接在一起形成成熟RNA分子的过程。这一过程主要发生在细胞核内，大致可分为组成性剪接和可变剪接。组成型剪接被认为是默认的途径，所有内含子从前体mRNA中移除，外显子以与基因组转录相同的顺序连接在一起。而可变剪接产生的外显子可以在不同的组合中插入或排除，从而从单个基因中产生不同功能的RNA，高达95%的人类基因具有多外显子可变剪接形式，这表明可变剪接是人类基因组功能复杂性中最重要的组成部分之一。

1 RNA结合基序蛋白介导的可变剪接概述

剪接是由剪接体进行的，剪接体是一种大的核糖核蛋白(RNP)复合体，主要存在于细胞核的剪接斑点中。可变剪接调控是由外显子和相邻内含子中发现的顺式调控元件介导的。顺式调控元件可以通过招募与RNA分子结合并充当反式作用因子的RNA结合蛋白来促进外显子的保留或剪切。

对可变剪接的适当调控对细胞生理学很重要，与主要反映转录本丰富度的启动子活性不同，可变剪接影响mRNAs及其潜在编码蛋白的结构。因此，它会影响许多基因产物的结合特性、细胞内定位、酶活性、蛋白质稳定性和翻译后修饰[1]。所以异常剪接可能导致细胞功能障碍和临床表现。越来越多的疾病，如癌、神经退行性疾病和自身免疫性疾病等都与可变剪接有关。然而，可变剪接的调控在心脏病研究中受到的关注相对较少。通过高通量测序和可变剪接分析，发现181个已知剪接因子中有47个在心力衰竭时上调。有趣的是，没有观察到剪接因子的显著下调[2]。

RNA结合蛋白(RNA binding protein, RBP)参与RNA代谢的各个方面，包括剪接、转运、翻译和稳定性[3]。任何特定的RBP与其底物的相互作用都是由RBP中的特定序列决定的，例如RNA识别基序、RNA结合基序、核糖核蛋白基序、富含精氨酸的基序、冷休克结构域[4]和精氨酸-甘氨酸-甘氨酸盒等，而大多数RBP有多个RNA结合序列，这反映了一个蛋白质与多种RNA分子结合的能力。RNA结合基序蛋白(RNA binding motif protein, RBM)，即RBM家族，由雨果基因命名委员会命名，均含有RNA识别基序、RNA结合基序以及核糖核蛋白基序；近年来的研究发现，RBM家族成员及其介导的可变剪接在一些疾病的发生发展中起重要作用，包括各种原因引起的心力衰竭。RBM家族成员介导的可变剪接与心肌疾病乃至心力衰竭相关研究目前主要集中在RNA结合基序蛋白20、24和25。

2 RBM20介导肌联蛋白的可变剪接

编码RBM20的RBM20基因已被初步鉴定为扩张性心肌病(dilated cardiomyopathy， DCM)的连锁基因之一[5]。RBM20是脊椎动物特有的RNA结合蛋白，由1 227个氨基酸残基组成，作为剪接因子相对较大，但它只有3个保守的可识别功能结构域：两个锌指结构域和一个RNA识别基序型RNA结合域[6]。其在心脏和骨骼肌中高度表达，在2%～3%的家族性和散发性DCM病例中发现了RBM20基因异常[7]。对RBM20敲除的大鼠及存在和不存在RBM20突变的人类DCM患者的心脏转录本进行高通量RNA测序(RNA-seq)共发现了31个基因，这些基因的可变剪接在大鼠和人类中均依赖于RBM20。RBM20主要通过与目标外显子的上游和/或下游的内含子结合来抑制盒式外显子，包括TTN (Titin)和Ryr2基因中的那些外显子。相互排斥的外显子也在RBM20目标外显子中富集。例如，RBM20抑制外显子15和16，并促进编码钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ-δ(CaMKⅡ-δ)的CAMK2D基因中的外显子14。

RBM20是心脏特异性TTN pre-mRNA剪接的主要调控因子。在人类心力衰竭队列中，内源性RBM20的低表达与TTN基因的剪接模式相关。肌节是促进横纹肌收缩的基本结构单位。肌联蛋白(TTN)是肌节的一个重要组成部分。在结构上，TTN起着生物弹簧的作用，横跨肌节的一半，并将Z盘连接到M线上。心肌细胞中基于TTN的被动张力占据了整个心肌的很大比例。它与TTN弹簧区的分子质量或氨基酸序列长度呈负相关。例如，在心肌中，有两种主要的肌动蛋白亚型表达：较短的N2B亚型只包含可变区中的N2B特有元件；较长的N2BA亚型含有N2B和N2A特有的元件以及可变长度的中间Ig重复结构域，与N2BA相比，N2B具有更短的弹性区域[8]，因此给予心肌细胞更高的被动张力。因此，人们认为肌动蛋白亚型的比例以及肌动蛋白的总量影响心肌被动张力[9]。N2B亚型与N2BA亚型的比例在不同的物种间及心房心室之间均不同，在发育过程中也是动态调节的。在扩张型心肌病心力衰竭、射血分数降低的心力衰竭和慢性缺血性心肌病中，N2BA亚型的数量增加[10]，而在高血压心脏病引起的舒张功能障碍中观察到N2BA亚型的减少。

在动物模型中，通过操纵TTN Pre-mRNA剪接来提高TTN的顺应性，可以扭转舒张功能障碍，从而TTN剪接调控因子RBM20可以作为潜在的治疗靶点。利用RBM20敏感的TTN剪接报告进行了小分子化合物的高通量筛选证明卡烯内酯部分地通过降低培养细胞中RBM20的蛋白水平来抑制RBM20介导的TTN外显子的抑制[11]。

3 RBM24异常剪接引起心肌发育障碍

RBM24是一个进化上保守的RBP，在其N-末端含有一个RNA结合基序。近年来的研究使它成为细胞分化的重要调节因子和与人类疾病有关的潜在因子。虽然到目前为止还没有发现人类RBM24基因突变与任何疾病有关，但其表达水平的不足可能与心肌疾病密切相关，在不同的动物模型中已经证明了该基因的关键作用。研究暗示脊椎动物的RBM24似乎参与了几乎所有方面的转录后调控。重要的是，在心肌和骨骼肌中，它是调节选择性剪接以建立收缩功能的关键因素[12-14]。

剪接因子RBM24控制着大量的肌肉特异性剪接事件[15]。小鼠体内RBM24的靶向失活扰乱了心脏发育，并导致胚胎在13.5 d左右死亡。这些胚胎显示出多种心脏畸形，例如室间隔缺损，以及室壁的小梁减少和增加。然而，最引人注目的观察是在突变的心肌细胞中肌节几乎完全消失。这与斑马鱼的心功能丧失研究是一致的[16]， RBM24缺乏导致肌节蛋白减少，Z盘异常和心肌收缩力减弱[15]。对RBM24基因敲除小鼠心脏的RNA测序(在表型开始之前)和随后的体外剪接分析显示，RBM24至少控制68个剪接事件，主要是通过促进肌肉特异性外显子的保留。一些依赖于RBM24的剪接转录本在心脏发育、肌节形成、肥大或扩张型心肌病中发挥关键作用。与心脏生物学相关的RBM24剪接靶基因包括Naca[16]、Fxr1、Abcc9、Slc25a3、Usp25和Usp28。然而RBM24敲除小鼠的胚胎致死性降低了其在成人心脏中的功能分析的可能。因此，为了阐明RBM24在成人心脏中调控的剪接事件，人们对RBM24条件性敲除等位基因的产生和分析充满了极大的兴趣。

RBM24作为关键的剪接调节因子对心脏早期发育必不可少几乎已经被明确[12, 17]。然而，出生后的心脏伴随着重大的剪接变化。对出生后RBM24的功能进行系统分析，发现500多个与RBM24有关的调控不当的异构体开关[14]，而其中大多数在研究心脏早期发育的研究中是没有发现的[12, 17]。这些异常的异构体开关可能导致生物力学和信号通路的改变，最终导致收缩受损、心力衰竭和出生后死亡。TTN即是其中之一，RBM24促进了TTN外显子11和13的保留，这两个外显子位于Z盘，参与肌原纤维的组装、稳定和维持。因此，RBM24基因的缺失可能导致RBM24基因缺陷小鼠Z盘内细丝数量和分布减少，影响Z盘结构，导致心功能不全[14]。RBM24亦可能与p53 mRNA结合并与翻译起始因子eIF4E相互作用，通过阻止eIF4E与p53 mRNA结合并抑制翻译起始复合物的装配来参与心力衰竭的发生发展[18]。

4 RBM25介导钠通道的可变剪接可引起心脏疾病

RBM25定位于核斑点，研究强烈提示它在前体mRNA的加工过程中起作用，并且这种调节是基因特异性的。对心力衰竭患者和健康对照人的心脏样本进行微阵列分析显示LUC7L3和RBM25分别上调了1.7倍和1.5倍。RBM25的作用是由LUC7L3介导的，LUC7L3是一种酸中毒和低氧敏感的剪接因子，是酵母U1 snRNP相关因子的人类同源物，在mRNA前体剪接中起作用。LUC7L3有两个锌指结构[19]。第一个使Pre-mRNA交联，是LUC7L3剪接活动所必需的。LUC7L3通过其第二个锌指在Pre-mRNA和U1 snRNP之间起桥梁作用。RBM25选择性地与LUC7L3结合，并通过与外显子剪接增强子顺式元件CGGGCA的相互作用激活剪接，如促凋亡的Bcl-xs 5′端等。

RBM25和LUC7L3共同介导了心脏钠通道(sodium voltage-gated channel alpha subunit 5, SCN5A) mRNA的可变剪接，进而引起一系列的心脏事件，如心力衰竭和心律失常，观察整个SCN5A mRNA序列发现，在检测到SCN5A剪接变异体的地方，RBM25只有一个结合位点[2]。凝胶电泳迁移率分析显示，SCN5A外显子28上的序列CGGGCA结合了RBM25，剪接调控因子的上调和下调证实了RBM25是必要的，也是足以导致SCN5A mRNA异常剪接的。事实上，心力衰竭会导致两个SCN5A变异体的增加，分别命名为E28C(39 bp)和E28D(114 bp)，SCN5A mRNA变异是由SCN5A末端外显子(外显子28)的隐性剪接序列剪接引起的。与全长钠通道相比，SCN5A变异体更短，编码的钠通道蛋白过早截短，没有从结构域Ⅳ、S3或S4到C末端的片段。

血管紧张素2(angiotensin2, Ang2)和低氧是LUC7L3/RBM25复合体上调和SCN5A mRNA剪接异常的信号。在人胚胎干细胞来源的心肌细胞(human embryonic stem cells-cardiomyocytes, hESCs-CMs)中，低氧使SCN5A变异体E28C和E28D的表达分别增加3.7倍和6.4倍，而全长SCN5A转录本的表达降低0.7倍。在Ang2作用下，SCN5A变异体E28C和E28D的表达分别增加2.9倍和4.3倍，而全长SCN5A转录本的表达降低0.8倍[2]。

这种异常的RNA剪接效应可能是由于RAS激活而导致Na+通道启动子下调的相加作用。根据芯片分析和NF-κB亚基的过度表达显示，Na+通道下调似乎是由p50/p65亚基与SCN5A启动子结合介导的[20]。这种的慢性效应可能与之前报道的Ang2或氧化应激的急性效应相加，增强了Na+通道的功能障碍。因此，在与氧化应激和肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)激活相关的病理生理条件下，可能会对Na+通道产生多种急性和慢性的有害影响。

除了NF-κB对Na+通道启动子的直接作用外，该转录因子可能在可变剪接中发挥作用。低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)是低氧时升高的关键转录调控分子。HIF-1α的启动子含有NF-κB结合元件，NF-κB是HIF-1α激活过程中的上游调控因子[21]。其中，HIF-1α mRNA调控剪接因子LUC7L3和RBM25，提示NF-κB激活可能是心脏氧化应激、炎性反应或低氧过程中该通道选择性剪接的上游。

5 问题与展望

虽然已经从遗传学上证明了某些RBM(如RBM20)的突变导致了DCM，但随后的心脏转录组分析和动物模型均尚未确定RBM20所调节的其异常剪接与DCM的每一种症状(如收缩功能障碍、左心室扩大和室性心律失常)密切相关的基因。将最新的全长cDNA/mRNA直接测序技术应用于超长TTN转录本，将有助于阐明RBM依赖的异构体的精确剪接模式，有助于理解调控机制，阐明这些机制将有助于进一步理解心脏特异的选择性剪接调控，以及未来可能操纵RBM活性的治疗方法。

高度的调控使选择性剪接成为心脏病治疗的潜在靶点。在干扰剪接的方法中，反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides, AONs)的使用备受关注[22]。AONs的设计方式是将它们绑定到特定的剪接序列以操纵剪接。是否可以通过针对可变剪接调控的靶mRNA中RBM的RNA识别元件设计的AONs来实现这一点将是一件值得探索和期待的事情。