非洲猪瘟弱毒疫苗及病毒适应细胞的研究进展

李少丽 ， 王家福 ， 康 斌 ， 李建林 ， 尹忠良

(杭州佑本动物疫苗有限公司 ， 浙江 杭州 310018)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是猪的一种高度接触性、急性出血性传染病，是世界动物卫生组织(OIE)法定报告的七类动物疫病之一，其病原为非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)，属于非洲猪瘟病毒家族唯一成员，是一种基因组为170～193 kb、编码150多种蛋白的双链DNA病毒[1]。ASF最初于1921年在肯尼亚被发现[2]，之后在非洲撒哈拉沙漠以南、撒丁岛和意大利地区作为一种地方性疾病零星散发，2007年在格鲁吉亚发生[3]，2017年传播到包括俄罗斯在内的周边邻国，2018年在中国、韩国暴发[4-5]，2019年在越南暴发[6]，全球大范围ASF的暴发加大了养猪业防控ASF的难度。目前，国内外还没有任何商品化疫苗批准上市，猪场主要通过加强生物安全，早发现、早排查、精准剔除等措施进行防控。

1 ASF弱毒疫苗研究进展

ASFV感染存活的猪可抵抗同种病原的感染，提示学者们开发ASF疫苗也许可对该病产生很好的控制，实际上自ASF发生以来，关于ASF疫苗的研究从未间断。然而传统的灭活疫苗、重组蛋白疫苗、DNA疫苗和DNAs/蛋白组合疫苗的免疫效果均不理想，因此，人们将焦点转向ASF弱毒活疫苗，无论是自然分离弱毒株还是基因工程弱毒株，当ASFV毒力充分致弱的情况下，可对同源甚至异源毒株产生一定的攻毒保护。

人工致弱的ASFV毒株大多是采用基因工程技术敲除其毒力基因构建的，目前研究较多的ASFV毒力相关基因有MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、CD2v、9GL、DP148R、UK、TK和NS-L等。CD2v(也称EP402R)基因编码ASFV血凝素。Monteagudo等[7]以强毒力BA71毒株为亲本毒株，敲除CD2v后构建BA71ΔCD2，在COS-1细胞上连续传20代，收获上清制备疫苗，其免疫原性和保护效果与用猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophage，PAM)培养所制备的疫苗无明显差异；BA71ΔCD2制备的疫苗接种6～8周龄试验猪，不仅可以抵抗致死量BA71的攻击，还可抵抗致死量异源毒株E75(也是I型)的攻击，推断出这种交叉保护与BA71ΔCD2引起的可同时识别BA71和E75病毒的CD8+T细胞的产生有关。然而，不是所有缺失CD2v基因的ASFV制备的疫苗都能达到良好的免疫效果。Borca等[8]将缺失CD2v基因的ASFV Georgia 2010毒株接种外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，半数血球吸附量(50% hemadsorbing doses，HAD50)试验未出现红细胞吸附现象，但以102～104TCID50/mL的剂量鼻腔接种试验猪与亲本毒株试验猪表现出相似的病毒血症和临床症状，表明敲除CD2v基因只能稍微减弱ASFV Georgia 2010毒株的毒力。Chen等[9]构建了多基因家族MGF360-505R、CD2v和MGF360-505R联合缺失的重组病毒，在PAM上制备和纯化后，接种7周龄SPF猪，并用亲本毒株HLJ/2018进行攻毒，结果以103和105TCID50/mL的HLJ/18-6GD和HLJ/18-7GD(以HLJ/18为骨架构建的6基因缺失株和7基因缺失株)免疫的试验猪均能存活，并可抵抗200个猪半数致死剂量(PLD50)HLJ/18的攻击。此外，将HLJ/18-6GD和HLJ/18-7GD两个重组病毒分别在猪体内连续传5代，结果，HLJ/18-6GD传至第4代时在猪体内复制能力增强，其中1头猪在第5次传代后11 d死亡，提示病毒毒力返强风险较高；而HLJ/18-7GD则比较安全，将HLJ/18-7GD接种妊娠母猪后未使母猪产生明显的繁殖障碍，安全性试验和毒力性试验结果均表明HLJ/18-7GD具有作为ASFV疫苗候选株的可行性，目前该重组疫苗正在进行商品育肥猪的临床试验，不同剂量接种组免疫保护率均在80%以上。

Zsak等[10]用强毒力毒株E70和2株Vero细胞适应的ASFV毒株(MS16和BA71V)感染PAM，结果显示E70可以在PAM上复制，在感染后48 h病毒滴度可达107TCID50/mL，而MS16和BA71V感染后检测不到病毒滴度，但这2种毒株在Vero细胞上可以正常复制，基因序列分析显示，MS16 和 BA71V2这2种病毒缺乏MGF360和MGF530基因，表明这2种基因可促进病毒在巨噬细胞中繁殖，在决定病毒宿主范围中起关键作用。Reis等[11]以Benin 97/1为骨架，构建可以调节I型干扰素(IFN)的MGF360和MGF530/505双基因缺失的重组病毒Benin△MGF，免疫试验猪后用致死量Benin 97/1攻击，结果所有试验猪均在接种5～6 d后出现一过性发热，无任何其他临床症状，而OURT88/3毒株同样缺失这2种基因接种试验猪后，有3/4的猪产生攻毒保护，表明不同分离株缺失MGF360和MGF530/505这2种基因后的效果不同。另外，Benin△MGF接种试验猪5～7 d后血清中分泌IFN-γ的细胞数量增多，而接种OURT88/3后相应细胞数量增多不明显，因此，推测保护性免疫反应可能与诱导的T细胞反应不同有关。

另外，也有将ASFV的DP148R、TK、NS-L基因缺失构建重组病毒的报道。DP148R是ASFV感染早期转录的基因，Reis等[12]将ASFV强毒株 Benin 97/1敲除DP148R基因构建重组病毒接种猪骨髓细胞(Porcine bone marrow cell，PBM)，并于接种后24、48、72 h和96 h取样检测病毒滴度，发现Benin△DP148R与Benin 97/1表现出几乎相同的生长曲线，Benin△DP148R在接种后24～48 h病毒滴度可达106TCID50/mL，重组病毒在猪巨噬细胞上的复制能力没有明显降低。然而，Benin△DP148R对猪的致病力却明显降低，Benin△DP148R接种的所有猪全部存活，表明DP148R虽不是病毒复制必需基因，但在宿主的免疫防护中起关键作用。ASFV在感染细胞的胞质内复制并合成病毒DNA复制所需要的各种酶基因，如胸腺激酶基因(TK基因)。Moore等[13]将ASFV Malawi毒株的TK基因敲除后制备重组病毒，重组病毒在Vero细胞上生长良好但在猪巨噬细胞上的生长受到抑制，接种重组病毒的试验猪只出现短暂的发热和较低的死亡率，重组病毒对猪的致病力降低，再用亲本毒株攻击试验猪未出现ASFV典型症状，表明TK基因是ASFV在猪巨噬细胞复制的必需基因，也是ASFV的毒力基因。Zsak等[14]以ASFV E70毒株为骨架，缺失高度保守的NL-S基因构建重组病毒，结果NL-S基因的缺失并未影响重组病毒在猪巨噬细胞或Vero细胞上的复制，但对猪的致病力却明显降低，表明NL-S基因是ASFV复制的非必需基因，也是ASFV的毒力基因。

ASFV有24种基因型，基因组庞大且大部分功能未知，据目前研究结果可以看出，影响病毒毒力的基因不止一种，不同毒株即使缺失相同的毒力基因产生的致病效果也可能不同，因此，构建多基因缺失的重组病毒也许是开发活疫苗候选毒株比较好的选择。

2 ASFV适应细胞的研究进展

目前，ASFV活疫苗制备和商业化生产的主要问题是缺乏支持重组病毒复制并保持良好免疫原性的细胞系。单核巨噬细胞、包括肺泡巨噬细胞在内的组织巨噬细胞和猪骨髓细胞是ASFV感染猪的主要靶细胞，它们在抗原提呈、细胞因子分泌和吞噬过程的免疫反应中起重要作用[15-16]。King等[17]将ASFV弱毒株OURT/88/3在猪骨髓巨噬细胞中培养，Gallardo等[18]将NH/68毒株在PAM细胞中培养，两者均可对异源强毒株UG65的攻击产生100%保护。Genovesi等[19]在猪骨髓细胞和血液单核/巨噬细胞的培养液中加入鼠源集落刺激因子(CSF-1)，可使具有典型单核巨噬细胞形态和功能的巨噬细胞数量增加，加入CSF-1的试验组与对照组相比，在接种ASFV后的病毒滴度和细胞病变增强，表明CSF-1可增加ASFV对细胞的敏感性，并延长细胞在体外的存活时间。

虽然用猪的原代细胞PBMC或PAM接种ASFV重组病毒与自然感染途径非常相似，有利于研究ASFV和宿主细胞之间关系，但这些细胞制备繁琐、批次间差异大、从动物中提取细胞成本高，限制了疫苗抗原的规模化量产。为此，研究学者曾尝试用已建立的细胞系培养ASFV。Krug等[20]将ASFV Georgia07毒株在Vero细胞上传110代后，病毒在家猪体内的复制能力丧失。Balysheva等[21]发现，ASFV的Stavropol 01/08毒株在A4C2/9K细胞中繁殖33代后丧失了致病性。Gallardo等[18]和Sánchez等[22]将弱毒株NH/P68在COS-7细胞上培养后，其对试验猪的免疫保护力降低至33%，但在野猪肺(Wild boar lung，WSL)细胞上传代后仍可感染猪并在猪体内繁殖。Krug等[20]将猪脾脏中分离的ASFV-G毒株在Vero细胞上传110代，比较ASFV-G毒株与细胞适应毒株在Vero细胞和猪巨噬细胞上的繁殖能力，结果显示，随着传代次数的增加，ASFV-G对Vero细胞的适应能力逐渐增强，病毒滴度可达107TCID50/mL以上，相反，在猪巨噬细胞上的繁殖能力下降，至第110代毒株的毒力完全丧失，而用细胞适应毒株免疫试验猪后不能保护ASFV-G的攻击；基因序列分析显示，ASFV对PAM细胞感染力的丧失可能是由于在Vero细胞传代过程中缺失了MGF360和MGF505基因所致。Carrascosa等[23]对ASFV在肺泡细胞、单核细胞和Vero细胞中的产量进行了比较，得出采用单层培养时，PBMC或者PAM感染ASFV后产生的病毒粒子要比感染Vero细胞高出10倍；未经任何处理的悬浮培养的PAM细胞比卡介苗(BCG)处理过的细胞所产病毒粒子量略少，但相差不多；虽悬浮培养的PAM细胞比贴壁方式产生的病毒粒子略少，但相比单层培养，悬浮培养系统更简便，更容易获得大量细胞；此外，PBMC比PAM虽产生稍多的病毒粒子，但PBMC不容易获得。因此，PAM的悬浮培养也许是可进行ASFV规模化放大培养的良好系统。值得关注的是，近期，日本学者Masujin等[24]在猪原代肾巨噬细胞中利用慢病毒载体引入SV40T基因和猪端粒酶逆转录酶基因，建立了永生化的猪肾巨噬细胞系(Immortalized porcine kidney macrophages，IPKM)，结果显示，IPKM细胞系对ASFV强毒力毒株Armenia07、Kenya05/Tk-1和Espana75以及人工致弱毒株Lisbon60V均易感，且可产生明显的细胞病变，推测IPKM也许可感染各种毒力和基因型的ASFV分离株。Portugal等[25]开发的猪巨噬细胞系(Zuckermann macrophage-4，ZMAC-4)对多种ASFV野毒分离株易感，ASFV致弱毒OURT88/3在ZMAC-4细胞上具有与在猪原代骨髓细胞上相似的感染动力学曲线和病毒滴度，且OURT88/3病毒在ZMAC-4细胞上传12代不改变该毒株的免疫原性，因此，ZMAC-4细胞可能是研究ASFV繁殖的良好选择。

综上，采用现有猴源肾细胞系如Vero、COS-1、COS-7等培养ASFV或其重组病毒，虽操作简便，容易规模化培养，但就目前研究结果看，传代容易引起某些基因缺失和移码突变，进而导致病毒复制力或免疫原性改变。而猪源原代细胞(如PAM、PBMC和PBM等)虽容易培养各种ASFV分离株和重组病毒，并能保持病毒的免疫原性，但制备繁琐、批次间差异大、不易规模化培养，同时还涉及到动物福利，也限制了其规模化量产。对于新开发的IPKM和ZMAC-4细胞及其他正在研究中的细胞系，需持续关注和进一步探究其作为病毒复制候选载体的可行性。

3 展望

非洲猪瘟为我国一类动物疫病，非洲猪瘟相关疫苗研究工作必须在P3及以上生物安全等级实验室获批开展，而目前包括我国在内的其他国家均未见批准上市销售使用的非洲猪瘟疫苗。我国农业农村部兽医局专家强调，所谓“非洲猪瘟中试苗、自家苗，甚至走私苗”，没有通过科学、客观、严格的评审评价，其安全性和有效性都无法保证，特别是活疫苗，更可能存在不可预知的生物安全风险，违规使用不仅控制不了非洲猪瘟疫情，反而会造成病毒扩散，扩大病毒污染面，进而干扰非洲猪瘟防控工作。因此，在当前形势下，养殖场(户)加强猪场的生物安全防护水平，提高自主防护意识，是最现实且最经济有效的选择。当然，我们也希望安全性更高、免疫效果确实的非洲猪瘟疫苗能够尽早批准上市，造福养殖业。