垂体腺瘤免疫微环境及免疫治疗的研究进展

郭晓鹏，幸 兵，马文斌

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 神经外科，北京 100730)

垂体腺瘤(pituitary adenomas,PAs)是第二位常见的原发性中枢神经系统(central nervous system, CNS)肿瘤，约占所有原发性CNS肿瘤的17%[1]。垂体腺瘤通过对鞍区周围神经及血管组织产生占位压迫效应及分泌过量激素而对人体造成危害。绝大多数垂体腺瘤为良性，通过手术、药物治疗及放疗可将其治愈，但仍有约10%的垂体腺瘤表现有极高的侵袭性，且传统治疗方式对其无效，被称为难治性垂体腺瘤[2]。免疫微环境对肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移等过程有重要的调控作用。免疫治疗可打破肿瘤生长的温床，目前已成为难治性肿瘤及恶性肿瘤的第四大治疗方案， 对黑色素瘤等表现出了较好的治疗效果。近年来，针对垂体腺瘤免疫微环境及免疫治疗的研究开始兴起，垂体腺瘤微环境中免疫细胞、免疫分子及细胞因子的促肿瘤及抗肿瘤作用逐渐被认识，为寻找免疫治疗靶点提供了重要依据。

1 垂体腺瘤(PAs)的免疫细胞浸润

垂体腺瘤微环境中除肿瘤细胞外，还有多种免疫细胞浸润，主要包括淋巴细胞(T细胞、B细胞)、巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤(natural killer, NK)细胞等[3]。大多数免疫浸润细胞可发挥抗肿瘤免疫功能(如CD8+T细胞、M1型巨噬细胞、NK细胞等)，但也有部分免疫细胞可促进肿瘤的侵袭及生长(如CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞、M2型巨噬细胞等)[4-5]。抗肿瘤免疫细胞及促肿瘤免疫细胞共同影响着垂体腺瘤细胞的增殖及侵袭，不同垂体腺瘤组织中的免疫细胞组成存在显著的异质性。以下介绍垂体腺瘤微环境中主要的免疫细胞。

1.1 T细胞

T细胞是垂体腺瘤微环境中最常见的免疫细胞类型[3]。根据表面免疫分子表达及免疫功能不同可将T细胞分为多种亚型，包括细胞杀伤性CD8+T细胞、辅助性CD4+Th1细胞、辅助性CD4+Th2细胞、调节性CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞等；其中，前两种细胞有较强的肿瘤杀伤效能，后两种细胞可抑制抗肿瘤免疫。

相比于正常垂体组织，垂体腺瘤中T细胞浸润数量增加，且CD4/CD8及FoxP3/CD8比例升高；绝大多数垂体腺瘤中可检测出T细胞浸润[3, 6-7]。CD8+T细胞是垂体腺瘤中最重要的免疫杀伤细胞，而Treg细胞是重要的“免疫刹车”细胞。快速生长型垂体腺瘤(高Ki-67)及侵袭性腺瘤微环境中CD8+T细胞浸润比例明显下降，而CD4+T细胞及Treg细胞浸润比例明显升高[4, 8]。功能型垂体腺瘤中CD4+T细胞比例较无功能型腺瘤升高[9]。关于垂体生长激素(growth hormone, GH)型腺瘤的研究显示，CD8+T细胞的浸润比例与肿瘤向海绵窦侵袭及生长抑素类似物耐药呈负相关，侵袭性及耐药的GH腺瘤中CD8+T细胞含量较少[10]。T细胞相关的抑制性免疫微环境(CD8low CD4high FoxP3high，或低CD8/CD4及低CD8/FoxP3)可促进垂体腺瘤细胞增殖及侵袭性生长[2, 4]。

1.2 巨噬细胞

巨噬细胞是垂体腺瘤中最常见的非特异性免疫细胞。巨噬细胞可吞噬非自身抗原或将其呈递给细胞杀伤性T细胞或NK/NKT细胞，从而发挥免疫杀伤或抗原呈递作用。肿瘤微环境中的巨噬细胞可由血液中单核细胞迁移分化形成或来自于垂体组织局部的固有巨噬细胞。巨噬细胞根据免疫分子表达及免疫功能不同，分为抗肿瘤免疫为主的M1型巨噬细胞(CD163-)及促肿瘤免疫为主的M2型巨噬细胞(CD163+)。

正常垂体组织中的巨噬细胞主要分布在毛细血管周围，其中超过半数为M2亚型[4]。垂体腺瘤中巨噬细胞数量约为正常垂体组织中的3～4倍，且M2/M1比例升高约3倍[8, 11]。稀疏颗粒型垂体GH型腺瘤及零细胞腺瘤中巨噬细胞数量明显多于致密颗粒型GH型腺瘤及促肾上腺皮质激素(adrenocortico-trophic hormone, ACTH)型腺瘤，且巨噬细胞数量与垂体腺瘤的大小及海绵窦侵袭相关[11-12]。基于临床标本的流式细胞学分析及体外实验结果显示，M2型巨噬细胞作为促肿瘤免疫细胞，其浸润比例与垂体腺瘤侵袭性、肿瘤大小及增殖活性(Ki-67)呈正相关[8, 11, 13-14]。

1.3 中性粒细胞

中性粒细胞的肿瘤免疫作用具有两面性：在多数肿瘤中发挥免疫杀伤作用，但在部分肿瘤中也可具有促肿瘤作用，包括促进新生血管生成、诱导免疫抑制及协助肿瘤细胞远端转移等[4]。肿瘤微环境中的中性粒细胞根据免疫功能不同分为不同的亚群，如N1/N2 中性粒细胞、肿瘤相关性中性粒细胞及多形核中性粒细胞等，但并没有明确的免疫分子对中性粒细胞亚群进行有效识别[15]。垂体腺瘤微环境内的中性粒细胞数量远低于正常垂体组织，垂体GH型腺瘤内的中性粒细胞比例低于无功能型腺瘤[8]。

1.4 其他免疫细胞

肿瘤微环境中的B细胞多聚集在肿瘤边缘，高增殖性垂体腺瘤微环境中可见大量B细胞浸润，同时也可伴有大量巨噬细胞、CD4+T细胞及Treg细胞浸润[8]。

自然杀伤细胞(natural killer cell, NK cell)细胞可通过细胞表面受体与肿瘤细胞直接结合，发挥接触式细胞杀伤功能，NK细胞数量增加通常与良好的预后相关；肿瘤细胞也可将反应型NK细胞诱导为无反应型NK细胞，从而抑制抗肿瘤免疫反应[4]。垂体泌乳素型腺瘤患者外周血中NK细胞数量低于健康人群及溴隐亭治疗后的泌乳素型腺瘤患者[4]。

2 垂体腺瘤(PAs)中免疫分子表达

免疫细胞间及免疫细胞与肿瘤细胞间免疫分子的相互作用直接影响肿瘤微环境中免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤行为。垂体腺瘤免疫微环境中发挥重要作用的免疫分子主要包括程序性死亡受体1(programmed cell death 1, PD-1)、程序性死亡受体配体1(programmed death ligand 1, PD-L1)、C-X-C趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor 4, CXCR4)及C-X-C趋化因子配体12(C-X-C chemokine ligand 12, CXCL12)等。

2.1 PD-1/PD-L1

T细胞表达PD-1分子，肿瘤细胞及抗原提呈细胞表达PD-L1分子，PD-1/PD-L1结合后可通过促进细胞杀伤性T细胞凋亡并抑制Treg细胞凋亡发挥免疫抑制作用，从而避免过于严重的自身免疫损伤，同时也成为了肿瘤细胞免疫逃逸的重要机制之一[2, 16]。

功能型垂体腺瘤中PD-L1分子表达量明显高于无功能型垂体腺瘤，初发垂体腺瘤中PD-L1分子表达高于复发腺瘤[6, 9, 16]。垂体GH型腺瘤中PD-L1分子表达量与肿瘤细胞的增殖活性及血GH激素水平正相关[2, 7]。拮抗鼠ACTH腺瘤细胞的PD-L1分子表达可显著减小垂体腺瘤体积并降低血ACTH水平[16]。

2.2 CXCR4/CXCL12

CXCR4分子主要表达在垂体GH细胞、泌乳素细胞及ACTH细胞，而CXCL12主要表达在垂体ACTH细胞[4]。垂体腺瘤中CXCR4及CXCL12分子表达量明显高于正常垂体。CXCR4可促进肿瘤细胞增殖；拮抗CXCR4分子可促进GH3大鼠垂体腺瘤细胞凋亡并抑制其增殖。侵袭性垂体腺瘤中CXCR4/CXCL12分子表达量高于非侵袭性腺瘤；CXCL12可促进垂体腺瘤中新生血管生成，高水平CXCL12与组织低氧代谢相关[17]。

3 垂体腺瘤(PAs)中细胞因子分泌

免疫细胞及肿瘤细胞可分泌一系列细胞因子，调节形成抗肿瘤或促肿瘤的免疫微环境或对已有微环境造成影响[5]。白细胞介素(interleukin, IL)及趋化因子配体(chemokine ligand, CCL)是垂体腺瘤微环境中的重要细胞因子。

3.1 IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17

IL-1在人垂体腺瘤、鼠AtT-20 垂体腺瘤细胞系及大鼠GH3 垂体腺瘤细胞系有表达，可促进GH和促甲状腺激素分泌，抑制泌乳素释放，但其与肿瘤细胞增殖的相关性存在争议[4]。IL-2在人ACTH腺瘤、鼠AtT-20细胞系及大鼠GH3细胞系中有表达，可促进GH及ACTH分泌及泌乳素释放，并促进人及大鼠GH细胞增殖[4, 18]。IL-6在人垂体腺瘤各亚型中均有表达，可促进GH分泌及泌乳素释放，且与肿瘤侵袭性生长相关[19]；IL-6可促进大鼠GH3细胞增殖及DNA合成[18]。垂体GH腺瘤细胞可持续大量分泌IL-8及IL-6；生长抑素治疗可抑制IL-8及IL-6分泌，而IL-1β可促进IL-8及IL-6分泌。IL-8水平与巨噬细胞及中性粒细胞浸润呈负相关，其可促进垂体腺瘤细胞侵袭性生长并降低对传统治疗的反应[8]。侵袭性垂体腺瘤中高表达IL-17，且IL-17表达量与肿瘤侵袭性成正比，IL-17水平高的垂体腺瘤难以达到全切。

3.2 CCL

CCL2-CCL4是垂体腺瘤中的主要趋化因子[8]。CCL2-CCL4由垂体腺瘤细胞分泌，无功能型腺瘤分泌量明显高于GH型腺瘤，但以上趋化因子水平与肿瘤细胞的增殖活性及侵袭性无明显相关性[4]。CCL2-CCL4可趋化巨噬细胞及中性粒细胞进入肿瘤微环境中，巨噬细胞及中性粒细胞比例较高的垂体腺瘤中CCL2-CCL4水平也较高[8, 14]。CCR5水平在芳基烃受体相互作用蛋白(aryl hydrocarbon receptor interacting protein, AIP)基因突变的垂体腺瘤中与正常垂体组织无差异，而在AIP野生型垂体腺瘤中显著升高；CCL5也可趋化巨噬细胞进入肿瘤微环境[11]。

3.3 其他细胞因子

γ干扰素(interferon gamma, IFN-γ)可抑制垂体腺瘤细胞的分泌及增殖；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)水平在侵袭性垂体腺瘤，尤其是侵袭骨质的垂体腺瘤中明显升高[19]，其也可通过上调血管内皮生长因子表达促进腺瘤内出血[4]；转化生长因子(transforming growth factor beta, TGF-β)可抑制泌乳素腺瘤细胞增殖及分泌泌乳素，抑制GH细胞增殖[4]。

4 垂体腺瘤(PAs)免疫治疗的动物模型研究

垂体腺瘤动物模型的建立为免疫治疗机制的探索提供了可能。在LAF1杂交鼠皮下及颅内可应用ATT/D16v.2细胞系成功建立垂体腺瘤模型，该模型高表达免疫抑制性分子PD-L1，其表达量仅次于黑色素瘤，并远高于胶质瘤、肺癌及乳腺癌模型[16]。针对该模型的抗PD-L1治疗可显著减小垂体腺瘤体积、降低血ACTH水平、延长杂交鼠生存期。国内也有学者应用Wistar大鼠腹腔注射乙烯雌酚建立垂体泌乳素型腺瘤模型、应用F344鼠口服雌酮建立垂体腺瘤模型、应用摘除双侧卵巢后的Wistar大鼠腹腔注射雌激素建立垂体泌乳素型腺瘤模型等成功案例。

5 人垂体腺瘤(PAs)免疫治疗的临床研究

对于难治性垂体腺瘤及垂体癌，目前仍无有效的治疗方法[2, 20]。近年来，对肿瘤免疫微环境的研究识别出了多种潜在有效的治疗靶点；其中，PD-1和CTLA-4是肿瘤免疫治疗的常用靶点分子[2, 5]。在垂体腺瘤免疫治疗领域有两项针对PD-1及CTLA-4分子的临床试验正在进行中(NCT04042753及NCT02834013)，均处于招募患者阶段。文献中已有3例对垂体腺瘤患者进行免疫治疗的个案报道。第一例报道为难治性垂体ACTH腺瘤伴肝转移的患者，在接受了4次手术、两次放疗及替莫唑胺+卡培他滨化疗后，肿瘤仍进展；应用抗PD-1及抗CTLA-4联合治疗后，垂体腺瘤缩小59%、肝转移灶缩小92%、ACTH水平由45 550 pg/mL 降至66 pg/mL[21]。第二例为复发性垂体ACTH腺瘤患者，肿瘤经过抗PD-1治疗后并未缩小[22]。第三例患者为垂体ACTH腺癌，应用抗PD-1及抗CTLA-4联合治疗后肿瘤稳定[23]。基于转录组数据的研究表明，垂体腺瘤微环境中PD-1及CTLA-4分子的表达量不高但异质性较高[3]；因此，以上3例免疫治疗个案的成功与否具有较大偶然性。全面识别垂体腺瘤的免疫微环境对筛选免疫治疗靶点至关重要，且最终的免疫治疗效果有待临床试验证实。

6 问题与展望

6.1 垂体腺瘤(PAs)免疫微环境认识不足

目前针对垂体腺瘤免疫微环境中细胞分布的研究较少，且免疫细胞识别多依赖于单个蛋白标志物的免疫组化染色结果，如识别巨噬细胞仅应用CD68阳性作为标准，此类识别方式可能会高估或错误估计某类细胞的比例[11-13, 24]；基于单细胞多个蛋白标记的高通量质谱流式分析技术或单细胞测序技术可对免疫细胞进行准确识别。

同一分子可表达在不同细胞上，如B7-H3可表达在巨噬细胞、肿瘤细胞及NK细胞表面，从而发挥不同的生物学作用，既往免疫组化结果仅可识别某分子表达的总体比例，而无法分辨分子所附着的细胞类型；而质谱流式或单细胞测序技术可了解某种免疫分子在每类细胞的表达比例，从而提供更为精确的基于细胞的分子靶点。

既往文献仅关注了热门免疫细胞及分子，其他潜在有效的“非感兴趣”免疫治疗靶点可能被忽略，如B7-H3分子等[25]；质谱流式或单细胞测序技术可实现对免疫微环境的全面探索，通过与临床特征进行匹配，识别出所有可能与肿瘤侵袭、生长、进展相关的免疫微环境特征，并为后续应用细胞及动物实验进行验证提供重要基础。

6.2 垂体腺瘤(PAs)免疫治疗的临床前研究及临床研究不足

临床前的实验研究是临床研究的基础，也是临床研究得以成功实施及高效进行的重要保障。与恶性胶质瘤相比，关于垂体腺瘤免疫治疗的细胞及动物实验研究不足[16, 24]，限制了其向临床研究的转化进度。目前垂体腺瘤领域内在研的两项临床试验应用抗PD-1联合抗CTLA-4对垂体腺瘤进行治疗。然而，根据现有的临床前结果，PD-1及CTLA-4分子在垂体腺瘤中的表达水平整体不高而异质性高[3]，可能限制后续临床试验的结果。根据临床前研究结果得出潜在有效治疗靶点，对接受免疫治疗的患者按分子表达状态进行分组，之后进行针对性的分组研究可更加高效地利用现有资源，达到事半功倍的效果。

6.3 展望

免疫细胞、肿瘤细胞、免疫分子及细胞因子间复杂的相互作用形成了不同的肿瘤免疫微环境，使垂体腺瘤表现出不同的临床生物学行为。针对微环境中特定免疫细胞或分子的免疫治疗可能成为垂体腺瘤除手术、药物及放疗之外的有效治疗方案。应用基于单细胞的高通量质谱流式技术或单细胞测序技术对免疫微环境特征进行全面而精确的识别，是垂体腺瘤免疫治疗成功的关键。

关于垂体腺瘤免疫微环境及免疫治疗的研究仍处于初期阶段，应继续增加对该领域的研究。应充分认识到侵袭性及难治性垂体腺瘤患者基数较大，但针对以上肿瘤免疫微环境及免疫治疗的研究较为缺乏，限制了该类垂体腺瘤的治疗。通过逐步加深对垂体腺瘤免疫微环境的认识，之后通过临床前实验及后续临床试验进行免疫治疗探索及验证，有望改善侵袭性及难治性垂体腺瘤患者的预后。