环状RNAs在前列腺癌中的研究进展

冯天瑞，严维刚

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 泌尿外科，北京 100730)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是目前全球男性中发病率最高的恶性肿瘤之一[1]，在美国男性恶性肿瘤发病率中居首位。虽前列腺癌在中国的发病率低于西方国家，但近年来也呈逐年升高趋势，已成为男性泌尿系统发病率最高的恶性肿瘤[2]。尽管大部分早期前列腺癌预后较好，但目前的治疗方法仍对发生局部进展和远处转移的PCa治疗效果有限。前列腺癌的发生发展过程颇为复杂，许多相关分子生物学机制尚未明确。因此研究PCa的发生、发展机制对早期诊断及指导PCa治疗有重要意义。环状RNA(circular RNAs，circRNAs)是一类通过反向剪接(back-splicing)形成的共价闭合环状RNA分子。近年来，随着高通量转录组测序(RNA-seq)技术和生物信息学算法的发展，越来越多的circRNAs被发现并揭示其功能。环状RNA在肿瘤细胞增殖、凋亡、 血管生成及转移中均发挥着重要调控作用。circRNAs较其他线性RNA有着更高的稳定性且可被检出， 无论是其在肿瘤形成过程中的作用或是作为肿瘤诊断和治疗的潜在标志物和治疗靶点都有着巨大的研究潜力[3]。

1 CircRNAs的功能

1.1 CircRNAs调控microRNAs

MicroRNAs(miRNAs)是一类重要的基因表达转录后调节因子，其在几乎所有的人类恶性肿瘤的发病机制中均有涉及。自ciRS-7 (circular RNA sponge for miR-7)[4]的相关研究发表以来，关于circRNAs通过miRNA结合位点发挥海绵吸附作用调节miRNAs的研究一直是circRNAs功能研究的热点。事实上circRNAs可能并不仅限于通过包含多个单种miRNA的结合位点来发挥miRNA海绵作用，也可能作为多种不同的类型的miRNA海绵，分别调控多种miRNAs及整个miRNA家族以完成其功能[5]。此外，与上述的miRNA海绵机制不同，ciRS-7还可在神经元中通过调节miR-7稳定性或其运输进而调节其靶基因而发挥功能[6]。

1.2 CircRNAs与蛋白质结合

除了对miRNA的海绵吸附作用以外，circRNAs可通过其所含有的若干RNA结合蛋白结合位点与相关蛋白质发生海绵作用并调节基因表达。例如在人宫颈癌(HeLa)细胞系中，circ-PABPN1可以通过与RNA结合蛋白Hu-antigen R (HuR)作用而抑制PABPN1基因翻译[7]。除海绵作用外，部分circRNAs还可以通过调节蛋白之间的反应而发挥作用。如circFoxo3可发挥“脚手架”功能同时结合p53及MDM2蛋白以促进MDM2介导的对p53的泛素化作用以使其失活[8]。

1.3 CircRNAs调节转录及剪接

与上述的circRNAs多在细胞质中发挥功能不同， circRNAs还可于细胞核中在转录水平调控基因表达。某些circRNAs如ci-ANKRD52可通过与RNA聚合酶Ⅱ作用的方式调节其亲本基因ANKRD52转录；EIciRNAs (exon-intron circRNAs)则可通过U1 snRNP依赖的方式促进其亲本基因的转录；关于circMBL与MBL/MBNL1的研究则证明了circRNAs可以通过与传统线性剪接竞争调控基因表达[9]。

1.4 CircRNAs与蛋白翻译

由于缺乏传统翻译过程中所需的5′端帽结构和3′端poly(A)尾结构，circRNAs通常被认为是一种非编码RNA，但是现已有多项研究表明拥有内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites,IRESs)的人工circRNAs可以进行翻译[10]。尽管有研究发现有数千种circRNAs包含可能的开放阅读框(0RF)及上游IRES并具有编码蛋白质的潜能[11]，目前仅有circ-ZNF609， circMBL，circFBXW7等少数几种内源性circRNAs已被研究证明具有翻译的能力[10]。关于circRNAs蛋白翻译的研究仍需进一步深入探索。

2 前列腺癌领域的circRNAs相关研究进展

2.1 CircRNAs 在前列腺癌中的表达

有研究对比了正常前列腺组织与局限性原发前列腺癌组织，发现在两种组织中652种circRNAs表达量存在差异[3]，其中绝大多数(629种)在肿瘤组织中下调且不能完全用其亲本基因的表达下调而解释。进一步的研究则表明肿瘤组织中circRNAs的分子数目(circRNAs丰度)与细胞的增殖能力呈负相关。另一项研究分析了4种前列腺癌细胞系(LNCaP、V16A、22Rv1、PC-3)中共计25 036种circRNAs[12]，发现其中绝大部分circRNAs的丰度低于其同源线性RNAs，但有127种circRNAs的丰度显著高于其同源线性RNAs，而具有更加极端(过高或过低)的circRNAs分布的患者往往有着更差的预后。关于PCa细胞系中丰度最高的circRNAs和其对应的线性RNAs的研究则表明有11.3%的circRNAs在至少一种细胞系中为必需，而绝大多数(91.8%)必需circRNAs的同源线性对应则并非必需，这表明circRNAs调控细胞增殖的能力与其线性对照无关。从上述研究可以看到前列腺癌组织中有着丰富的circRNAs表达且与正常前列腺组织存在差异，对其的进一步研究有利于揭示前列腺癌发生发展的过程并提供新的可能的治疗靶点。

2.2 CircRNAs与前列腺癌的增殖和进展

2.2.1 调控microRNAs：CircZNF609在前列腺癌组织中高表达并可以负性调节miR-186-5p，而沉默circZNF609可以通过circZNF609/miR-186-5p/YAP1/AMPK通路促进前列腺癌细胞的增殖及侵袭[13]。Hsa_circ_0001206在前列腺组织中表达显著下调，其可通过与miR-1285-5p结合的方式通过hsa_circ_0001206/miR-1285-5p/Smad4信号通路在体外和体内抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭及肿瘤生长[14]。CircAMOTL1L可以作为miR-193a-5p的海绵，通过circAMOTL1L/miR-193a-5p/Pcdha轴抑制前列腺癌细胞的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和迁移及侵袭过程[15]，而p53可直接激活RBM25的表达，进而间接促进circAMOTL1L的形成。CircABCC4在前列腺癌组织及细胞系中均表达上调，且其可作为miR-1182的海绵上调FOXP4表达以促进前列腺癌进展[16]。

与以上研究中circRNAs主要发挥海绵作用调控miRNAs不同， circCSNK1G3为多种前列腺癌细胞系所必须，而其可以通过miRNAs稳定机制与miR-181b/d协同调控CBX7(一种前列腺癌中的肿瘤抑制因子)以调节肿瘤细胞增殖能力[12]。

2.2.2 调控蛋白及信号通路：Circ-102004在前列腺癌组织中表达显著升高，其可通过调节EPK,JNK,Hedgehog,及Wnt/β-catenin等信号通路促进前列腺癌细胞增殖和侵袭，抑制其凋亡，并促进肿瘤在动物模型体内生长[17]。Circ0005276可以通过与RNA结合蛋白FUS作用而激活其亲本X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP) 基因表达，从而促进前列腺癌细胞增殖与迁移[18]。

2.3 CircRNAs与前列腺癌耐药

雄激素剥夺治疗(androgen deprivation therapy,ADT)是治疗进展期前列腺癌，特别是转移性前列腺癌最重要的手段之一。但随着病情进展，往往会发生耐药并最终转变为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC)。即便阿比特龙(abiraterone)、恩杂鲁胺(enzalutamide,Enz)等新型抗雄药物的出现延缓了这一进程，绝大多数患者发生耐药无可避免。雄激素受体(androgen receptor,AR)剪接变体(AR splice variants,AR-Vs)的出现是导致CRPC的重要原因之一[19]，表达AR-V7(androgen receptor splice variant-7)的患者往往对阿比特龙及恩杂鲁胺耐药且AR-V7高表达患者较其他CRPC患者生存期更短[20]，而环状RNA可能参与了这一过程。CircRNA17在CRPC C4-2恩杂鲁胺耐药(EnzR-C4-2)细胞系中较恩杂鲁胺敏感(EnzS-C4-2)细胞系表达降低；而在EnzS-C4-2细胞系中抑制circRNA17表达可提高AR-V7表达，并导致Enz耐药和肿瘤细胞侵袭[21]。CircRNA17可通过正向调节miR-181c-5p表达影响AR-V7表达而发挥上述作用。此外，在前列腺癌细胞系中沉默circFoxo3会促进其增殖、侵袭，并增强对多西他赛的耐药性，而外源性补充circFoxo3则可以增强荷瘤小鼠对多西他赛的敏感性并延长其生命[22]。由此可见对circRNAs的研究可以进一步揭示前列腺癌耐药的发生机制，为延缓和避免耐药发生提供新的切入点。

2.4 CircRNAs作为生物标志物

由于缺乏开放的末端结构，circRNAs比它们的同源线性转录产物更加稳定并可以抵抗核糖核酸外切酶(RNase R)处理，同时其可以在前列腺癌患者的多种体液成分甚至尿液中被可靠检测[3]，因此circRNAs是一种理想的前列腺癌潜在生物标志物。

AR基因的过表达及其可变剪接产物如AR-V7表达是CRPC形成及预后不良的生物标志。circAR3是一种前列腺组织特异的circRNA，其来源于AR基因，而血清中的circAR3水平可以正向反映原发肿瘤的Gleason评分以及淋巴结转移情况[23]。有研究[24]在47例转移性去势抵抗前列腺癌(mCRPC)组织标本中共筛选出了13种来源于AR基因的circRNAs(circARs)，其中丰度最高的4种circARs在CRPC组织中均表达上调。在CRPC组织中circARs的表达水平和线性AR转录产物表达水平显著相关，因此circARs有潜力成为新型的mCRPC患者的生物标志物。此外，还有研究发现circ-AURKA可作为前列腺癌伴神经内分泌分化的一种特征性标志物来鉴别癌的亚种[3]。

2.5 不同的声音

虽然近两年在前列腺癌领域涌现出的大量关于circRNAs的研究使得人们对circRNAs在前列腺癌发生发展中的作用有了更深入的了解，但也存在一些争议。如两项不同的探究circFoxo3在前列腺癌组织及细胞系中的表达及功能的研究对于前列腺癌组织和正常前列腺组织中circFoxo3表达的对比给出了相反的结论[22,25]。造成该差异结果的一个可能的解释是其中一项研究开展于不同的标本中，而另一研究则对比了相同标本中的前列腺癌组织和正常组织。此外，前一研究认为沉默circFoxo3表达可以促进前列腺癌细胞增殖、侵袭并抑制其凋亡；而另一研究则认为circFoxo3发挥促癌功能，沉默其表达可显著抑制前列腺癌细胞增殖并促进其凋亡。即便两者的实验方法和细节存在诸多差异，但是从相反的结果看出目前关于circRNAs的研究仍存在一定的局限，对其研究的深度尚浅，有待在此领域进一步探索。

3 问题与展望

得益于高通量RNA测序技术及生物信息学的发展，越来越多的证据表明过去被认为是转录错误而形成的circRNAs其实在包括恶性肿瘤在内的多种疾病进程中发挥重要的调控功能，其独特的环状结构及特性也使其成为了一种理想的潜在生物标志物。CircRNAs在前列腺癌领域的研究让人们对前列腺癌发生发展及耐药产生等机制有了更深入的认识，并为以后的前列腺癌治疗提供了新的可能的方向。但是目前对于circRNAs的功能及相关机制的研究仍处于开始阶段，存在许多尚未解决的问题，且距离临床应用仍存在一定距离。同时一些研究的结果及其解释也存在着矛盾和争议，有待更深入的研究来解答。总而言之，鉴于circRNAs在恶性肿瘤领域广阔的研究前景和潜力，相信后续关于circRNAs的研究可以为从前列腺癌到其他恶性肿瘤的诊治提供新的策略。