胚胎发育生物标志物的研究进展

谢聪聪，王雪莹，安 卓，姚胜杰，马 婧，王树松,*

(1.河北省计划生育科学技术研究院 河北省生殖医院 国家卫生健康委员会计划生育与优生重点实验室河北省生殖医学重点实验室，河北 石家庄 050071； 2.河北医科大学 研究生学院， 河北 石家庄 050017)

自1978年世界首例采用体外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)技术的婴儿诞生以来，相关的辅助生殖技术得到迅速的发展，全球运用辅助生殖技术已经诞生了500 多万人，但辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)的妊娠率亟需提高。体外受精的最终目的是植入具有最高发育潜能的胚胎，而影响卵子受精、胚胎发育和植入的因素有很多。胚胎质量直接影响体外受精的结局，如何评估胚胎的发育潜能是研究的热点。目前，对胚胎质量的评估方法主要有形态学、蛋白组学和代谢组学等。代谢组学主要通过对生物新陈代谢过程中代谢产物的变化规律进行研究，揭示生物体生理和病理状态下生长及发育各个环节的特点。代谢组学在ART方面具有很重要的意义，胚胎代谢物与胚胎发育之间有着密切的关系。将形态学、蛋白质组学和代谢组学结合，有望确定胚胎生长发育的生物标志物，快速、非侵入性的鉴别优质胚胎，提高ART的妊娠率。现将胚胎发育生物标志物的研究进展进行总结。

1 氨基酸是胚胎发育过程中的关键调控参数

整个机体氨基酸的生物利用度和代谢与其他营养物质相互作用，对生殖的生理过程至关重要，包括配子发生、受精、植入、胎盘，胎儿生长和发育。氨基酸是培养基的重要组成部分，用于体外培养受精卵到囊胚阶段，培养液中添加氨基酸可增加胚胎体外培养的妊娠率[1]。

氨基酸代谢是卵母细胞发育所必需的。已发现卵母细胞减数分裂缺陷、细胞器功能障碍和表观遗传改变与细胞中氨基酸转运蛋白的降低和糖/脂含量的增加密切相关[2]。虽然胚胎形态相似，但是不同发育阶段胚胎氨基酸代谢确有不同，胚胎发育是否阻滞与其氨基酸的代谢利用率有明显不同。通过分析不同发育阶段胚胎的氨基酸代谢情况，第2～3天发育潜能较好的胚胎对谷氨酸、甲硫氨酸、精氨酸摄取量少，分泌丙氨酸和天冬酰胺较少；8细胞到桑椹胚阶段对丝氨酸摄取量少，而丙氨酸、甘氨酸释放量少[3]。整个胚胎发育过程中持续产生丙氨酸，持续摄取亮氨酸。高发育潜能的胚胎处于低氨基酸代谢状态。胚胎摄取天冬酰胺、甘氨酸和亮氨酸与临床妊娠和活产显著相关，胚胎培养液中妊娠组天冬酰胺的量较未妊娠者明显增加，而甘氨酸和亮氨酸明显减少，发育潜能较好的胚胎氨基酸代谢明显低于发育阻滞的胚胎[1]。采用高效液相色谱检测培养液，结果表明培养液中谷氨酰胺和丙氨酸水平与妊娠结局呈负相关[4]。并且发现培养基中有6种氨基酸(天门冬氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天丝氨酸、亮氨酸和赖氨酸)代谢在整倍体和非整倍体胚胎之间存在明显差异[5]。

因此，氨基酸是胚胎发育过程中关键的调控参数，其利用率可作为检测胚胎发育潜能的合理指标，但是需要大量循证医学的结果，根据培养液氨基酸浓度指导优质胚胎的筛选。

2 碳水化合物是胚胎发育的主要能量来源

胚胎培养液中碳水化合物主要是葡萄糖和丙酮酸。胚胎发育所需的ATP有两个主要途径分别是有氧糖酵解和无氧糖酵解。在胚胎发育的早期阶段(致密化前)，丙酮酸和乳酸是其主要能量来源。到了胚胎发育晚期，葡萄糖摄取稳步上升，从桑椹胚到囊胚的过渡期，葡萄糖的利用率显著增加。葡萄糖可以通过线粒体的作用发挥其早期的有益效应，丙酮酸作为胚胎培养液底物的能源之一，它能够抑制卵母细胞的老化[6]。

2.1 丙酮酸与胚胎发育

丙酮酸对哺乳动物的发育潜力是必需的。在卵母细胞体外成熟过程中，猪培养基中添加丙酮酸可以提高受精率(metaphase Ⅱ，MⅡ)和囊胚率，进而提高早期胚胎发育潜能[7]。通过对第4天胚胎培养液分析，发现丙酮酸摄取量高的胚胎更容易形成囊胚[1]。植入率高的胚胎对丙酮酸吸收波动是相对较小的。然而2～8细胞的胚胎，丙酮酸的吸收与胚胎活力和妊娠呈负相关[1]。

2.2 葡萄糖与胚胎发育

糖是胚胎培养液中主要的能源物质，在胚胎发育过程中糖主要以糖酵解途径、己糖胺生物合成途径和磷酸戊糖途径等发挥作用。因此，通过检测胚胎培养液中糖的吸收和代谢可以作为预测胚胎发育潜能的重要标记。对葡萄糖摄取高的囊胚发育潜能更高，优质胚胎对葡萄糖摄取量多[8]。妊娠组胚胎对培养液中葡萄糖的摄取显著高于未妊娠组[9]。葡萄糖与囊胚发育有着紧密联系，可以作为囊胚发育的一个生物标志物。

胚胎对葡萄糖及丙酮酸的摄取与妊娠结局的关系受到多因素的影响，如：研究对象的不同、周期特征、刺激方案、胚胎培养条件、仪器设备等。因此，把葡萄糖和丙酮酸作为胚胎发育生物标志物的实验研究需要进一步完善。

3 细胞因子是胚胎发育和植入潜能的标志

细胞因子是指由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成并分泌的一类生物活性分子，它们介导细胞之间的信息交换与相互调节，参与免疫应答、免疫调节和炎性反应过程。可溶性人白细胞抗原因子-G(soluble human leukocyte antigen G，sHLA-G)、β-人绒毛促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，β-hCG)、血小板活性因子(platelet activating factor，PAF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGFs)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、转化生长因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)、瘦素(leptin)等内源性“调节因子”可以作为胚胎发育和植入潜力的指标[10]。胚胎和子宫内膜分泌的细胞因子调控植入过程，在植入期间专注于母胎对话，现在对生物标志物的关注越来越多，因为它们可能在植入和妊娠过程中具有很好的预后特性。

3.1 sHLA-G与胚胎发育和植入潜能

白细胞抗原-G(human leukocyte antigen G，HLA-G)是一种具有限制性表达模式的非经典HLA-Ⅰ类分子，HLA-G主要由母胎界面外滋养细胞分泌的主要组织相容性复合分子，sHLA-G是HLA-G的蛋白产物，可结合NK 细胞抑制受体，保护胎儿免受母体免疫系统的杀伤，对维持正常的妊娠过程起着重要的作用。sHLA-G 在早期的胚胎培养液中存在表达，并且与胚胎的早期发育和种植密切相关[11]。大部分妊娠患者组HLA-G的浓度显著高于非妊娠组，针对卵胞浆内单精子注射(intracyto-plasmic sperm injection,ICSI)患者移植sHLA-G呈阳性的胚胎妊娠率和种植率显著高于移植sHLA-G 阴性组，因此sHLA-G 可以作为评价胚胎质量和获得更好临床结局的指标[10]。59.73 IU/mL sHLA-G是区分妊娠和持续妊娠患者与未妊娠或流产患者的最敏感和特异的阈值[12]。sHLA-G具有明确定义范围和标准单位可提供一种非侵入性方法来鉴定最适合移植的胚胎，可用作胚胎筛选的标志物。

3.2 β-hCG与胚胎发育和植入潜能

β-hCG在胚胎培养液中的定量被认为是滋养外胚层分化和囊胚活力的一个有力指标[10]。利用培养液中β-hCG水平来评价胚胎质量是辅助生殖领域研究的热点。胚胎培养液中总β-hCG水平能够区分形态相似的同级别胚胎哪个更适合移植。β-hCG在早期胚胎发育的各个阶段几乎均有表达，胚胎分泌β-hCG含量与胚胎种植潜能显著相关，并且单囊胚分泌β-hCG含量可预测囊胚质量，优质囊胚的β-hCG分泌量显著高于非优质囊胚和发育阻滞的胚胎[13]。

3.3 PAF与胚胎发育和植入潜能

PAF是一种脂质介质，具有多效生物学特性的信号磷脂。PAF在调控生殖生理各个方面起着重要作用，外源PAF与起始形成肌醇三磷酸和二酰基甘油的细胞表面受体结合，影响细胞内钙的水平，进而影响胚胎发育。人类、小鼠、绵羊、兔、猪等多个物种在植入前胚胎分泌PAF，在扩张囊胚的培养液中可检测PAF的含量。胚胎分泌的PAF在胚胎代谢，生长和发育过程中具有重要作用，外源性添加PAF可刺激胚胎代谢和分裂，提高胚胎生长和发育，胚胎分泌PAF含量增加，相应的妊娠率也会增加[14]。因此，PAF可以作为筛选胚胎和预测妊娠结局的标志物。

3.4 IGFs与胚胎发育

IGFs是一种具有多功能细胞增殖调控的多肽物质， IGF-1和IGF-2是目前发现胰岛素样生长因子家族中仅有的成员。胚胎分泌的IGF-1可刺激对葡萄糖的摄取，并且对胚胎细胞增殖和分化起着重要调控作用。多囊卵巢综合征患者卵泡液中高水平IGF-1其获卵数、卵裂数、优质胚胎数、临床妊娠率高于低IGF-1水平组[15]。在胚胎培养液中补充IGF-1可能会通过脂质代谢、卵母细胞功能和线粒体功能相关基因的差异表达而影响胚胎的能力[16]。IGF-2对胚胎的发育速度起着调控作用。胚胎培养液中IGF-2的浓度随着胚胎的生长而增加，并且在桑椹胚到囊胚转化时浓度较高，可很好地检测到，在人胚胎培养液中添加IGF-2后滋养层细胞凋亡率降低[17]。IGFs对胚胎的发育具有一定的作用，但是否是胚胎植入前的重要因素需要进一步验证。

3.5 其他生物标志与胚胎发育和植入潜能

EGF和TGF-α具有相似的氨基酸序列，且均与EGF受体结合，属于表皮生长因子家族的成员。EGF受体可能参与胚胎早期发育和着床过程，在胚胎发育过程中可能发挥特定作用，胚胎的特定生长因子以自分泌或旁分泌方式参与着床前胚胎发育和囊胚的形成[18]。在牛胚胎的培养基中同时添加了牛血清白蛋白和EGF，提高了囊胚的孵化能力和囊胚的细胞总数，提高了滋养层细胞的入侵能力[19]。Leptin是一种16 ku的小型营养肽，在人囊胚培养液中可检测到大量的leptin，囊胚分泌的leptin显著高于早卵裂的胚胎，leptin通过调控卵丘激活因子来调节卵母细胞的发育能力，促进囊胚的多能性[20]。白介素-6(interleukin-6，IL-6)添加到人的胚胎培养液中显著促进了胚胎的发育，增加了 IL-6浓度与胚胎质量的相关性可能与囊胚形成时间有关，D6组囊胚胚胎液中IL-6浓度显著高于D5组[21]。通过对单个微滴培养液中IL-6分析，结果表明妊娠囊胚组对IL-6的摄取增加，IL-6在囊胚发育和植入中具有潜在作用。在胚胎培养液中添加IL-1β显著增加囊胚质量[22]。

细胞因子相互作用网络复杂，基于单个细胞因子的检测评估胚胎质量相对困难，联合检测多因子，甚至是联合形态学特征、发育动力学特征等综合评估是十分必要的。目前，实现单个胚胎培养液中多个细胞因子的共同检测具有一定的前景。

4 蛋白质组学相关的胚胎发育生物标志物

随着蛋白质组学技术的发展，对人类胚胎分泌物的研究越来越深入。在人类胚胎分泌物的初期研究，主要进行单个蛋白质或分子的靶向分析。时间质谱发现在第3天胚胎的分泌物中检测到蛋白，观察到蛋白质表达谱与胚胎发育明显相关，第一个成功分析人类胚胎分泌蛋白质的表达谱，并提出通过对胚胎分泌物的分析可提供非侵入性的胚胎评估方法[23]。非整倍体和整倍体胚胎分泌的蛋白等代谢产物之间具有明显差异，载脂蛋白1(lipocalin-1)确定为非侵入性非整倍体筛选的潜在生物标志物。非整倍体囊胚的lipocalin-1的分泌增加可以代表胚胎本身的受损状态，反映了非整倍体囊胚的情况[24]。

由于受研究过程的限制，如蛋白质浓度低、仪器设备检出限低等，目前对植入前胚胎分泌蛋白质的认识有限。但胚胎发育的蛋白质组学分析对胚胎发育选择是一种比较好的方法，具有很好的发展前景。

5 问题与展望

本文总结了近些年与胚胎质量有关的物质，都有可能成为筛选胚胎的生物标志物。由于胚胎发育是一个复杂的过程，包括卵子受精、胚胎分裂、增殖、植入等多个因素，如何运用无创的方法精准筛选出最具发育潜能的胚胎是研究的难点和热点，目前还没有明确筛选胚胎的唯一标准，但可以通过胚胎发育的生物标志物筛选优质胚胎和发育潜能高的胚胎。根据胚胎的不同发育阶段，在每一阶段选择合适准确的标志物，这是未来辅助生殖技术的研究方向和热点。在新技术的基础上，进一步研究标志物对胚胎发育的机制，使标志物评价胚胎发育成为普遍可行的方法。