男男性行为者CCR5、CCR2、SDF1、CXCR4基因多态性与HIV-1感染关联性分析

蒋红伟 田洪青

1临沂市疾病预防控制中心,山东临沂,276001；2山东第一医科大学附属皮肤病医院(山东省皮肤病医院)，山东省皮肤病性病防治研究所,山东济南,250022

艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)引起的慢性传染病，近年来，男男性行为者(men who have sex with men, MSM)多性伴、无保护性行为较为普遍，已成为HIV传播的重点人群[1-4]，进一步从源头上探索对该人群有效的防控措施至关重要，大量研究表明趋化因子及其受体作为HIV感染的重要辅助受体，参与HIV感染宿主细胞甚至会影响艾滋病的疾病进程[5-8]。关于MSM人群趋化因子及其受体多态性与HIV感染相关文献较少，工作中发现不是所有暴露于HIV的人都会被感染，少数有暴露史的MSM多性伴无保护性行为一直未被感染，这种抵抗现象与宿主基因多态性的关系有待进一步明确，本调查通过检测山东汉族MSM人群CCR5、CCR2、CXCR4、SDF1基因多态性变化，分析病例组和对照组基因型差异与HIV-1感染的关系，以更好地为本地区艾滋病防控工作提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 193例调查对象全部为山东汉族MSM，均有过MSM不安全性行为，依据是否感染HIV病毒分成病例组和对照组，病例组收集102例经HIV-1抗体确证检测阳性的患者，对照组纳入91例HIV抗体筛查检测呈阴性者。所有样本来源于临沂市各县、区疾控中心、抗病毒治疗定点医院和艾滋病自愿咨询检测门诊收集，经过个案流行病学调查、填写问卷并采集血液标本，由临沂市疾病预防控制中心按照《全国艾滋病检测技术规范(2015年修订版)》[9]的要求进行的样品检测，阳性患者均经临沂市艾滋病确认实验室蛋白印迹法(western blot，WB)确认的HIV-1抗体阳性病例。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 在知情同意的前提下填写调查问卷，采集外周静脉血3～5 mL，EDTA抗凝，置-80℃冰箱中保存备用。

1.2.2 外周血DNA提取 基因组DNA提取使用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒，按照试剂盒说明书进行，所提取DNA产物经浓度和纯度测定合格后置-20℃条件保存备用。

1.2.3 PCR反应 基因扩增仪 ETC811由东胜创新生物科技有限公司生产；全自动数码凝胶图像分析系统由上海天能科技有限公司生产；ABI3730XL型DNA 测序仪为Applied Biosystems；试剂为BGI 2×Super PCR Mix(with dye)BGI。

引物设计根据NCBI中人类CCR5基因rs333和rs1799987位点、CCR2、SDF1、CXCR4外显子序列设计合成引物，引物序列和大小见表1。扩增条件为96℃预变性5 min，96℃变性20 s，52-62touchdown退火30 s，72℃延伸1 min，10个循环，96℃变性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸5 min保存。

表1 CCR5、CCR2、SDF1、CXCR4扩增位点上下游引物

1.2.4 PCR产物纯化和测序 全程委托华大基因公司对样品进行基因重测序。产物纯化按照Millipore公司96纯化板操作流程进行。测序反应体系为2 μLMix(Bigdye3.1、5X sequencing buffer、 H2O)，2 μL纯化后的PCR产物，1 μL引物(5 mmol/L)。测序反应程序为：循环条件为：95℃15s→(95℃15 s→50℃5 s→60℃90 s)×3 5cycles→终止反应。

1.3 统计学方法 运用SPSS 21.0软件进行统计学分析，群体代表性采用哈-温平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)检验，若P>0.05,则认为各基因型的分布符合HWE平衡。等位基因频率(allelic frequency, AF)分布差异应用卡方检验或Fisher精确概率法，多因素分析采用二分类Logistic回归模型，分析比值比和95%置信区间(CI)，以P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 人口学和行为学特征 193例均为男性，年龄中位数为31岁(17～62岁)；其中未婚98例(50.7%)，已婚68例(35.2%)，离异或丧偶27例(13.9%)；小学文化程度8例(4.1%)，初中81例(41.9%)，高中或中专47例(24.3%)，大专及以上57例(29.5%)； 商业服务40例(20.7%)，农民60例(31%)，学生12例(6.2%)，自由职业者63例(32.6%)，干部工人18例(9.3%)；与性伴发生性行为时使用安全套频率：从未使用56例(29%)，有时使用117例(60.6%)，每次都用20例(10.3%)；性伴数>3个94例(48.7%)，性伴数≤3个99例(51.2%)；无保护性行为次数>3次116例(60.1%)，无保护性行为次数≤3次77例(39.8%)。

2.2 哈-温平衡检验结果 经HWE平衡检验，除CCR2基因rs777084052、rs369723235、rs993589500、SDF1和CXCR4基因rs1299134173及第一外显子位点外，病例组和对照组CCR5、CCR2和CXCR4基因rs1799987、rs1799864、rs1799865、rs2228014位点基因型及其相对应的预测值如下，所研究群体符合HWE平衡(P>0.05)(表2)，调查对象具有群体代表性和可比性。

2.3 CCR5测序结果 193例样本未发现rs333位点存在插入缺失突变，参考序列为GTCAGTATCAATTCTGGAAGAATTTCCAGACA；rs1799987A/G位点检出三种基因型(表2)，分别为AA占18.1%(35例)、AG占44.6%(86例)和GG占37.3%(72例)，A/G突变频率为59.6%，对照组、病例组等位基因A、G发生频率分别为43.41%、56.59%和37.75%、62.25%，两组不同年龄、职业和安全套使用频率进行比较，基因型分布差异有统计学意义(均P<0.05)，将基因型AA与其他(AG、GG)两类基因型作为因变量(突变=0,未突变=1)，将病例组和对照组差异有统计学意义(P<0.05)的变量作为自变量，进行非条件二分类 Logistic 回归分析，显示rs1799987A/G位点变异可能为影响HIV-1感染的风险因素[比值比(OR)=2.998，95%可信区间(CI)：1.034～8.696]，结果见表3。

表2 CCR5、CCR2、SDF1、CXCR4多态性位点测序分析

表3 rs1799987位点基因型分布二分类Logistic回归分析结果

2.4 CCR2测序结果 共扩增两个外显子，发现5个已知多态性位点(rs1799864、rs1799865、rs777084052、rs369723235、rs993589500)。第2外显子T>C突变82例，其中病例组47例，对照组35例；病例组发现C>T突变1例；G>A突变71例，其中病例组38例，对照组33例；发现CC纯合子17例，其中病例组10例，对照组7例；AA纯合子8例，病例组2例，对照组6例。第3外显子发现复等位基因9组，SNP位点碱基均为杂合突变，发现A>T突变23例，病例组和对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，结果见表2；将基因型AA与其他(AG、GG)两类基因型作为因变量(突变=0,未突变=1)，将年龄、职业、婚姻状况、文化程度、安全套使用频率、性伴数等纳入多因素Logistic回归模型分析，均显示无明显相关。

2.5 SDF1测序结果 193例样本SDF1共扩增4个外显子，发现2个已知多态性位点(rs1444139047、rs17880170)，第1外显子对照组发现T>C突变1例；第2外显子病例组发现G>A突变1例；第3外显子未发现插入缺失突变；第4外显子对照组发现C>A、G>A突变各1例、病例组发现G>T突变1例，见表2。

2.6 CXCR4测序结果 扩增1个外显子，发现2个已知多态性位点(rs2228014、rs1299134173)，C>T突变对照组发现21例，病例组发现22例；病例组和对照组各发现1例TT纯合突变；病例组1例杂合缺失TG插入AT，见表2。

3 讨论

研究发现HIV侵入机体，除CD4分子介导外，必须有趋化因子受体作为辅助受体参与，HIV-1才能有效感染人体，并在HIV感染及疾病进程中发挥重要作用[5-8,10]，CCR5作为HIV病毒传播最重要的受体，发生CCR5△32杂合子或纯合子突变的个体能有效抵御HIV的感染[11]，本组资料测序产物未发现CCR5△32纯合或杂合子突变，结果不排除与所选样本量少及入选人群突变率低有关。研究表明CCR5基因启动子59029A/G位点，欧美人群突变频率为39%～43%，亚洲人群为55%～61%[12]，本研究MSM人群A/G突变频率为59.59%，提示山东汉族MSM人群该位点等位基因突变频率较高。既往研究显示HIV血清阳性与阴性者GG基因型存在显著差异，与感染HIV-1的风险有关[6]，本组资料G等位基因频率病例组(62.25%)高于对照组(56.59%)，多因素分析也发现A/G位点等位基因变异可能是HIV-1感染的风险因素，是否与感染风险相关尚待更多研究数据进一步证实。国外研究报道59029A/G基因突变可减少CCR5的转录，从而减缓HIV的感染过程，相对于AA个体，GG基因型对感染具有保护作用[13]，本组资料A的基因频率病例组低于对照组，现有数据不支持GG基因型对感染具有保护作用这一结论。

王福生等[14]研究发现中国人群CCR2-64I等位基因突变频率为19.15%～28.79%,既往报道白种人该突变频率9.8%，本研究发现MSM人群为19.95%，与报告的中国人群研究数据相近，并明显高于欧美人群。研究表明CCR2最常见的多态性突变为CCR2-64I，本组资料发现79例样本存在CCR2-64I突变，为编码区第190位核苷酸G→A突变导致第64位的缬氨酸替代为异亮氨酸。本研究也发现CCR2第3外显子区域出现23例A>T突变，为cDNA水平上1109位置发生的杂合突变，第370位天冬氨酸替代为缬氨酸，病例组和对照组基因型差异有统计学意义，多因素logistic回归模型分析发现与年龄、职业等无明显关联，推测两组之间差异可能系混杂因素影响所致。

SDF1是CXCR4的主要配体，文献报道最常见的突变为SDF1-3'A，该突变可延缓AIDS疾病进展，另有研究发现SDF1-3'A等位基因纯合子突变可以加速疾病进展和死亡[15]，本研究未发现SDF1-3'A发生纯合子突变，5例突变均为杂合子突变，其中两例均为HIV感染者,CD4均在500个/μL以上，感染时间均在4年以上，暂未证实SDF1对HIV感染及感染较长时间疾病进程等方面的保护作用。研究显示SDF1-3'A等位基因频率地域差异明显，美国白人为21.1%，亚洲人为25.7%[16]，我国人群呈现由南到北频率呈梯度下降趋势，最高广东33.3%，河南21.8%，济南21%[17]，Winkler等[18]报道亚洲人SDF1的突变频率为0.257%，本研究MSM人群SDF1突变频率为0.26%，显示该人群突变频率与亚洲人群基本一致。

CXCR4是T细胞嗜性病毒HIV-1感染的主要辅助受体，与更具致病性和更快的艾滋病进展相关，并且由于CD4+T细胞的进行性和定量下降而导致更高的艾滋病相关死亡率[10]，本组资料发现SNP位点rs2228014密码子138位置C>T杂合突变42例，氨基酸位置无变化，纯合子突变病例组和对照组各1例，病例组和对照组比较多态性差异未见有统计学意义。病例组发现cDNA序列上17-18位置SNP位点发生杂合突变，缺失TG插入AT1例，既往未见相关报道，与HIV感染是否有相关性尚需更多数据进一步探讨。

综合现有资料，关于山东汉族MSM人群CCR5、CCR2、SDF1、CXCR4基因多态性与HIV-1感染关联性，可获得的信息有限，结论不一，建议纳入更多暴露未感染人群，开展不同人群不同地域艾滋病发生、发展和转归等方面的HIV相关基因研究，为进一步做好艾滋病防控工作提供更多的参考依据。