细胞制剂支原体检测方法概述

陈耐寒， 撒亚莲

（昆明理工大学附属医院 云南省第一人民医院临床医学研究中心，云南 昆明 650032）

细胞治疗是除药物、手术、放化疗外，以活细胞制剂为主要成分来治疗或预防疾病的技术[1]。目前，细胞治疗领域的研究热点是干细胞和免疫细胞，均需遵照中国国家法律、法规与行政管理规定，其细胞来源、生产工艺和临床应用过程均需在符合伦理要求的前提下开展临床研究[2-4]。

支原体（Mycoplasma）是细胞培养过程中常见的外源性污染物[5]，开展支原体污染检测是细胞质量控制微生物学安全性评价体系中的一项重要内容[6]。由于活细胞制剂终产品不能灭菌处理，且《中华人民共和国药典》[7]规定的培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）检测支原体所需的时间较长，在细胞制剂终产品进入人体前不能获得检测结果，因而非常有必要建立细胞制剂放行检测的高时效性支原体检测方法。本文对支原体的生物学特性，以及支原体的形态学、培养法和核酸检测法的特点进行综述，为开展细胞制剂质量监测技术评价体系建设提供参考。

1 支原体的生物学特性

支原体是一类广泛存在于自然界的、最小的、没有细胞壁的原核细胞型微生物，大小为0.1～0.3 μm，可通过细胞培养技术中常使用的0.22～0.45 μm滤器，导致预防支原体污染的难度增加。支原体于1956年被正式命名，自1898年法国科学家Nocard和Roux首次分离该类微生物以来，现已分离出近200种支原体[8]。支原体为柔膜体纲（Mycoplasmas），在支原体目里有支原体科（Mycoplasmataceae）、无胆甾原体科（Cholesterogen free）和螺原体科（Spiroplasmataceae），其中支原体科由支原体属（Mycoplasma）与脲原体属（Ureaplasma）组成，支原体属有肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）、人型支原体（Mycoplasma hominis）、生殖支原体（Mycoplasma genitalium）、穿透支原体（Mycoplasma penetrating）和发酵支原体（Mycoplasma fermentans）等75余种。支原体革兰染色为阴性，吉姆萨染色为阳性[8-9]。

支原体生长缓慢，适宜的生长温度为35 ℃，pH值为7.6～8.0；但脲原体的最适pH值为6.0～6.5。支原体抵抗力较弱，对热、干燥、75%乙醇、煤酚皂溶液敏感，对红霉素、螺旋霉素、四环素、卡那霉素和链霉素等抗菌药物敏感，对青霉素类抗菌药物不敏感。支原体广泛存在于自然界，种类繁多，但仅部分支原体对人类有致病性，一般通过黏附在宿主上皮细胞表面成为人类、动物和植物的寄生物，通过摄取宿主细胞的胆固醇等营养物质和/或代谢产生的毒素、过氧化氢等有毒物质危害人类和动植物，给细胞制剂和科研工作带来负面影响。有的支原体可以进入人类细胞，如渗透支原体，可通过胞内定位能力保护其免受宿主免疫系统和药物的清除，导致隐性感染和慢性感染，使细胞培养物中的支原体污染难以清除[5，8-10]。由此可见，细胞制剂支原体污染监测及防治工作具有重要意义。

2 支原体污染对细胞的影响

培养细胞被支原体污染是世界范围的共性问题。有研究结果表明，在污染细胞中发现了口腔支原体（Mycoplasma oral）、猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）、精氨酸支原体（Mycoplasma arginine）、莱氏无胆甾原体（Acholeplasma laidlawii）等20余种支原体，有的细胞株可以同时被2种及以上的支原体污染[8-9，11]。支原体污染细胞初期一般不容易观察到细胞增殖和形态的改变；但被支原体严重污染，会导致细胞生长缓慢，折光性降低，细胞间出现膜片状的黏附结构；宿主细胞的核酸蛋白合成受到抑制会产生影响细胞存活的某些酶和细胞因子，使细胞的增殖受到抑制甚至停止，细胞体积变大，细胞碎片越来越多，最终导致细胞死亡。由此可见，支原体污染存在潜在的巨大危害，因此，开展支原体污染检测是细胞制剂质量保障的重要措施，是细胞制剂原材料制备、生产过程和终产品质量控制的核心指标。

支原体污染与细胞质量管理的5个影响因素（人员、设备、材料、方法和环境）密切相关，其来源包括污染的培养基、动物血清、胰蛋白酶，已污染的培养物气溶胶、已污染的培养箱以及操作人员等[5，8-9]；预防支原体污染涉及生产过程中的每个环节，必须严格执行质量管理规定，严格按照生产工艺和作业指导书要求进行细胞制剂的生产，重视原材料、生产过程和终产品的质量与监测是预防支原体污染的重要前提和有效措施。

3 支原体的检测方法

3.1 支原体的形态学检测

支原体大小为0.1～0.3 μm，形态各异，有球状、环状、丝状、分枝状；支原体无细胞壁，有细胞膜，胞内有核糖体、线粒体、多种酶类、RNA以及环状双链DNA。细胞制剂如果被支原体污染，用透射/扫描电镜可观察到在细胞表面和/或细胞核外、细胞周围、细胞间隙有支原体黏附，透射电镜可以观察到支原体胞内的超微结构[10]，但是电镜观察结果与操作者的技能和经验有关，而且耗时长，仪器昂贵。桂馨等[12]用二苯甲酰胺荧光染料（Hoechst33342）直接染色活细胞后，在荧光显微镜下观察到细胞周围或细胞膜上有大小不等、不规则的荧光着色颗粒或丝状物，推测为支原体，但在污染初期不易被发现，易出现假阴性；细胞碎片因容易被染料着色，而出现假阳性。支原体经吉姆萨染色后，在光学显微镜下呈淡紫色，染色方法简便、快捷；用相差显微镜如观察到细胞表面和细胞之间有暗色微小颗粒，可判读为支原体阳性。但是支原体形态学检测方法需要技术人员有丰富的经验，结果重复性差，支原体污染的直接证据是分离、培养到支原体，因此需要采用培养法进一步判定是否为支原体污染。

3.2 支原体的培养法检测

《中华人民共和国药典》规定的支原体检测方法培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）是检测支原体的“金标准”，能够检测不同生长特性的支原体，具有广谱性，但敏感性低，耗时长[7，11，13]。

支原体生长缓慢，能够在无生命培养基生长、繁殖；有的可在营养丰富的培养基上生长，如肺炎支原体；有的在细胞上生长得更好，如猪鼻支原体；有的尚不能培养，如植原体。但由于支原体DNA中编码氨基酸和辅助因子的基因极少，缺乏糖异生、三羧酸循环等代谢途径中的许多重要基因，使得支原体生长对营养的需求比一般细菌要高，除需要含有牛肉浸液、酵母浸粉、猪胃消化液、葡萄糖、精氨酸等蛋白胨的基础营养物质外，还需加入10%～20%人或动物血清，用于提供支原体生长、繁殖所需的胆固醇。基于支原体是分解葡萄糖还是利用精氨酸，分为2类支原体培养体系。解脲支原体虽然不能利用葡萄糖或精氨酸，但可以利用精氨酸水解生成的尿素；另外，根据培养体系中是否有琼脂及其含量又可分为液体、半固体与固体培养体系[5，7，9，11，13]。

在富含葡萄糖的支原体肉汤培养基中，支原体可因分解葡萄糖产酸，从而使液体培养基颜色变黄（pH值下降为酸性）；精氨酸支原体肉汤培养基颜色变为桃红色可提示有支原体生长，其可分解尿素，产生氨，使pH值上升为碱性；在半固体培养基中如观察到沿接种线呈烟雾状，则提示有支原体生长；在支原体琼脂固体培养基上可观察到圆形房顶样菌落，随着传代培养可观察到“油煎荷包蛋”样菌落，呈圆形，核心部分较厚，向下长入培养基，周边为1层薄的透明颗粒区。

指示细胞培养法（DNA染色法）是用已被证实无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞作为指示细胞，将待检测细胞（供试品）经无抗菌药物培养液至少传1代，然后取细胞长满，且3 d未换液的细胞培养上清液2 mL，加入到有指示细胞的培养孔，孵育3～5 d，传代到有盖玻片的6孔培养板培养3～5 d，再用固定液固定，荧光染料（Hoechst33342）染色，通过荧光显微镜观察，阴性对照组仅指示细胞核有荧光染色，支原体污染组可在细胞核或细胞周围观察到大小不等、不规则的荧光着色颗粒，或丝状的荧光带[12]。

培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）检测到的支原体均为活的支原体，一旦检测结果是阳性，即可证明样本中确实存在支原体污染。但是这2种方法仍具有一定的局限性：（1）2种检测方法都需要较长时间，培养法需要进行次代培养，耗时28 d；指示细胞培养法（DNA染色法）从指示细胞复苏，再经过盲传，约需14 d；（2）2种方法成本均较高，要求检测人员具有熟练技术；（3）2种方法均不能明确支原体的亚型。鉴于此，培养法虽然是检测支原体的“金标准”，但不适用于细胞制剂终产品的放行检测。当然，这并不意味着应取消细胞制剂终产品的支原体培养法检测，其检测结果可用于细胞制剂放行检测的验证。因此，选择和/或建立适宜的细胞制剂终产品放行检测的快捷、特异、敏感的支原体检测方法非常必要。

3.3 支原体的核酸检测

目前，核酸扩增检测技术（nucleic acid amplification technique，NAAT）因快速、特异、敏感、高效已成为支原体快速检测的首选方法[5，9，13-15]。世界卫生组织建议建立以核酸检测为基础的快速放行检测方法，并要求进行定量分析[16]。支原体的核酸检测主要是基于聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术扩增支原体基因组中某段特异性核酸保守序列来判断是否有支原体污染。近年来，随着NAAT的发展，在常规PCR基础上建立了巢式PCR、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、基因芯片、滚环复制扩增（rolling circle amplification，RCA）、数字PCR、PCR产物-直接测序与高通量测序[又称“下一代”测序（next generation sequencing，NGS）]等检测技术[13-23]。每种方法各有其优点与缺点，NGS通量高，无需设计特定的探针，在短时间内可获得支原体基因组的全部信息，且准确度高、成本相对低，但操作复杂，需有专门的分析软件和操作系统，且设备昂贵。

NAAT检测结果仅可提示细胞制剂中存在支原体基因组，但不能判断支原体是否存活，是否为支原体相近种属的微生物污染；也不能排除是否存在环境和/或试剂中的支原体核酸或质粒污染；且支原体种类繁多，设计扩增广谱性与特异性目的片段的PCR扩增引物有难度。支原体核酸提取、PCR扩增反应体系与扩增程序等均对扩增目的片段的效率有影响，可因无法检测到个别基因丢失或未转录导致假阴性。另外，在支原体与环境的交互作用中，容易出现基因组DNA变异，为设计特异性引物带来困难。因而，基于PCR技术的支原体核酸检测尚不能代替“金标准”方法，但可作为细胞制剂的快速放行检测方法。值得注意的是，开展支原体核酸检测时，需要对同一份样本采用支原体“金标准”方法检测，以验证PCR结果的准确性，方能确定其能否成为支原体的快速检测方法。

3.4 支原体的其他检测方法

支原体细胞膜有3层，厚度为7.5～10.0 nm，内外2层主要为蛋白质和多糖，中间层以含胆固醇的脂质成分为主。检测支原体细胞膜蛋白的Western blot技术是研究支原体致病机制的切入点，可确定是否存在支原体污染，但该技术耗时长、操作流程多，不适宜用于细胞制剂质量评价技术体系中的支原体检测。支原体能在孵化10～12 d的鸡胚绒毛尿囊膜中生长，但实验周期等因素会影响其在细胞制剂放行检测中的使用。尿核苷/尿嘧啶吸附比率、放射自显影法、支原体RNA聚丙烯酰胺法、瓜氨酸测定法、酶联免疫吸附试验等支原体检测方法[24]，也不适宜用于细胞制剂的检测。

4 总结

支原体是介于细菌和病毒间的、能独立存活的一类最小的原核细胞型微生物，广泛存在于自然界，种类繁多，是生物制品与细胞制剂中最常见的外源性微生物污染因子。支原体污染的直接证据是分离培养到支原体，培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）是支原体检测的“金标准”，但其检测时间长；基于PCR技术的NAAT快速、特异、敏感、高效，但有假阴性的可能；NGS越来越广泛地被应用于微生物宏基因组学研究，在1次测序反应中可获取支原体类型、耐药与毒力等相关基因信息，对细胞制剂质量监测及其评价体系的建立具有重要意义，或可成为检测细胞制剂终产品微生物污染的新型工具。支原体污染重在预防，对于细胞制剂生产过程中的原材料、生产过程的关键节点与细胞库的样品与活细胞制剂的放行检测，建议采用经过验证的PCR快速检测或NGS，联合支原体的“金标准”检测方法。围绕人员、设备、物料、方法、环境开展好细胞制剂的质量管理工作是预防支原体污染的关键；严格执行细胞制备相关的管理制度和操作规程是保证细胞质量的核心要素[25-26]。生物学领域科技水平飞速发展，相信快速、高效、特异性好、灵敏度高，兼顾广谱性的支原体检测方法会不断被开发出来。