基于高通量测序诊断马尔尼菲蓝状菌病1例报道

王增睿， 杨 霞， 宁 宗

（1.广西医科大学，广西 南宁 530000；2.广西医科大学第一附属医院全科医学科，广西 南宁 530000）

马尔尼菲蓝状菌（Talaromyces marneffei）又名马尔尼菲青霉菌，是一种双相性深部致病性真菌，最早在竹鼠的病变肝脏中被分离出来，多分布于东南亚、印度东北部和中国南部[1]。马尔尼菲蓝状菌感染好发于免疫功能低下或缺陷人群，主要累及单核巨噬细胞，可侵犯人体多个系统，临床表现复杂多样，病死率高，早期诊断和治疗是降低病死率的关键[2]。目前，马尔尼菲蓝状菌的主要检测方法为血液或组织真菌培养、涂片染色、病理学检查等，由于检出率不一、耗费时间较长等缺点，在一定程度上延误了该病的诊断和治疗[3]。高通量测序[又称下一代测序（next generation sequencing，NGS）]技术可不依赖于培养，直接检测临床样本（血液、脑脊液、肺泡灌洗液、尿液等）中微生物的DNA或RNA，通过分析其特异性基因片段的含量与丰度，通过生物信息学分析全面鉴定细菌、病毒、真菌、寄生虫。相较于传统检测技术，NGS具有通量高、鉴定谱广、检测时间短、敏感性好等优点[4-5]。目前，马尔尼菲蓝状菌引起人类感染的报道较少，此前有个案报道采用NGS诊断马尔尼菲蓝状菌致中枢神经系统感染[6]。现就广西医科大学第一附属医院1例基于NGS技术诊断马尔尼菲蓝状菌感染的病例进行报道，为此类病例的诊疗提供参考。

1 病例资料

患者，男，49岁，因“左下肢疼痛伴发热3月余”，于2020年3月10日急诊收入广西医科大学第一附属医院。患者于2019年12月29日无明显诱因出现左下肢疼痛，进行性加重，多位于左侧髋部、大腿内侧，伴发热，无畏寒、寒战，体温最高38.5 ℃。2020年1月2日至外院就诊，行髋关节磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）平扫：左侧髋臼及坐骨异常信号，考虑骨髓水肿，左侧闭孔内外肌、上下孖肌、股内侧肌、股四方肌、耻骨肌、臀大肌肿胀，水肿。血培养（双侧）：沙门菌，对头孢他啶、左氧氟沙星等敏感。双髋关节MRI：左大腿上段-左髋关节周围软组织改变，考虑炎性病变并脓肿形成，拟左侧股骨颈、左侧髋臼骨髓水肿。胸部电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）：考虑两肺炎症，纵膈及右肺门多发肿大淋巴结，不排除右肺下叶病变为占位可能；两侧少量胸腔积液；拟肺气肿（小叶中心型）改变。骨髓形态学检查：成熟浆细胞占11%，成熟红细胞呈缗钱状（多发性骨髓瘤待排）。胸骨前壁肿物B超：皮下混合性回声团（脓肿？）。于2020年2月6日行左大腿肌层脓肿切开探查引流及任意皮瓣成形术。脓液培养示阴沟肠杆菌。曾予氧氟沙星+美罗培南+万古霉素+复方磺胺甲噁唑联合抗感染治疗，治疗后患者仍有反复发热，为进一步明确诊断至广西医科大学第一附属医院就诊。既往史：否认高血压、冠心病、糖尿病史，否认肝炎、结核或其他传染病史，否认外伤史，有青霉素过敏史。入院查体：体温36.5 ℃，脉搏107次/min，呼吸22次/min，血压14.50/9.44 kPa。神志清，贫血面容，皮肤巩膜无黄染，全身淋巴结未扪及肿大，颈静脉正常。胸骨下段可见1块约4 cm×3 cm的肿物（图 1），有波动感，无触痛。左侧大腿内可见1条长约 5 cm的陈旧性疤痕。余未见明显异常。

图1 胸骨下段肿物

2 实验室及影像学检查

血常规示：白细胞计数20.21×109/L，血红蛋白60.60 g/L，中性粒细胞百分比85.4%。尿常规示：潜血（+）。肝功能：直接胆红素19.40 μmol/L，总胆红素33.40 μmol/L，白蛋白19.6 g/L，球蛋白47.5 g/L，γ-谷氨酰基转移酶215.0 U/L。肾功能检测示：肌酐116 μmol/L，尿酸440 μmol/L。D-二聚体6 436 ng/mL。高敏C反应蛋白（全程）210.70 mg/L。降钙素原2.170 ng/mL。细菌内毒素测定：228.60 pg/mL。真菌β-葡聚糖测定（G 试验）264.20 pg/mL。副流感病毒抗体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型-IgM 阳性（+）。葡萄糖6-磷酸脱氢酶活性（速率法）1 766 IU。血培养：未培养出细菌和真菌。腹部及泌尿系超声：肝大，肝右叶囊肿，脾大，前列腺钙化灶。骨发射型计算机断层扫描（emission computed tomography，ECT）：颅骨、胸骨下段、多根肋骨、右侧耻骨、左侧髋臼、左侧坐骨及双侧肩关节骨代谢活跃（图 2）。颅脑CT：颅骨多发病灶，符合朗格汉斯细胞组织细胞增多症改变；右顶部软组织肿胀（图 3）。胸部CT：双肺多发病变，朗格汉斯细胞组织细胞增生症肺部浸润？肺炎？双肺小叶中心型肺气肿；胸骨柄下端、两侧肋骨多发骨质破坏及周围软组织肿胀，符合朗格汉斯组织细胞增生改变（图 4）。

图2 全身骨扫描结果

图3 头颅CT结果

图4 胸部CT结果

患者于2020年3月12日行胸骨前壁肿物穿刺检查，采用Nextseq550 DX测序平台（英国Illumina公司）行高通量测序（测序策略SE75，总测序核苷酸序列2 000万条），经FastQC软件进行数据基本过滤后去除人相关reads，剩下的reads与优化后其专属的病原微生物数据库（包括15 000余个医学微生物信息）进行比对分析。3月15日病原微生物宏基因检测报告示：马尔尼菲青霉菌感染。2020年3月15日开始予两性霉素B脂质体10 mg qd治疗。2020年3月17日行左锁骨头囊性包块穿刺，抽液后接种在沙氏培养基（本实验室制备，原料为蛋白胨10 g、琼脂20 g、葡萄糖40 g、蒸馏水），分别在25和37 ℃环境下培养，动态观察各培养物不同温度、不同培养基、不同培养时间的菌落形态及特点。5 d后用透明胶带先粘取一定量菌丝，再粘在预先滴加乳酸酚棉兰染液（本实验室制备，原料为苯酚、乳酸、甘油、棉蓝、蒸馏水）的载玻片上，显微镜下观察菌丝的形态、特征、大小、排列等。3月23日显微镜下观察真菌特点符合马尔尼菲蓝状菌（25 ℃培养菌落呈青霉相，在高倍镜下可以看到特征性结构帚状枝；37 ℃培养菌落呈酵母相，培养物可见圆形或卵圆形的酵母样菌体），鉴定方法及结果与相关文献报道[8]一致。结合患者临床表现、影像学检查、实验室检查及NGS结果，最终诊断为播散型马尔尼菲蓝状菌病（肺、骨及皮肤）。

2 讨论

马尔尼菲蓝状菌感染起病隐匿，好发于免疫功能低下或缺陷人群，尤其多见于获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）患者。马尔尼菲蓝状菌感染可以侵犯人体多个系统，临床表现主要有发热、咳嗽、咳痰、腹痛、腹泻、淋巴结及肝脾肿大、贫血、皮肤丘疹或结节及骨质破坏（罕见）等。本例患者免疫功能正常，既往体健，临床表现为发热、贫血、脾大、淋巴结肿大、皮下脓肿、多发溶骨性损伤等，但由于临床症状不典型，缺乏特异性，易与结核病、多发性骨髓瘤等血液系统疾病相混淆，临床诊断较困难[7]。另外，随着AIDS及其他免疫性疾病发病率的增高，马尔尼菲蓝状菌病发病率逐年上升，病死率较高，因此早期诊断，及早应用抗真菌药物治疗是降低病死率的关键。

目前，血液及脓肿穿刺等临床样本的微生物培养仍是诊断该病的金标准。但微生物培养耗时长，需要1～2周，且样本取材不易，阳性率较低，导致马尔尼菲蓝状菌病早期诊断困难。有文献报道马尔尼菲蓝状菌可以侵入血液及骨组织，累及骨髓，且取材简单、耗时较短，因此骨髓细胞学检查也是诊断该病的重要方法[3，9]。但目前马尔尼菲蓝状菌导致骨损伤较罕见，且程度不一，如本例患者感染后导致骨质被破坏，但骨髓细胞学及病理检查未见异常，提示骨髓细胞学检查等传统检测技术存在敏感性差、时效性差和误差大等缺点，且往往对临床罕见的病原微生物无法识别。

NGS可直接提取临床样本中的基因组DNA进行测序，将所测序列与专业数据库进行对比，得出样本中所含病原体的信息，并可直接分析样本中的病原体谱、丰度及分布情况。与传统病原体检测技术相比，NGS具有测序通量高（可检测范围包括基因序列已知的细菌3 233余种、真菌265余种、病毒4 192余种、寄生虫及其他病原体274余种）、检测时间短（1～2 d）、敏感性较高、检测谱广（犬咬二氧化碳嗜纤维菌、波瓦桑病毒、猪疱疹病毒等特殊、少见病原体亦可检出）等优点[4，10]，可以实现对未知病原体的快速鉴定，有助于疾病的早期诊断和治疗。目前，NGS在临床中的应用正处于发展阶段，仍存在一定的问题，如难以有效分辨致病菌和背景菌，且成本较高。但应认识到NGS的临床价值，使其成为临床诊断的有效工具，促进精准医学的发展[11]。

综上所述，当患者出现不明原因的发热、贫血、脾大、淋巴结肿大、皮下脓肿及溶骨性损害时，应高度怀疑特殊病原体感染。临床工作中，如遇到病原学诊断不明或高度怀疑特殊病原体感染的患者，使用常规检验方法难以有效查出病原体，应尽早考虑采用NGS进行病原体检测，以提高早期诊断准确率，避免漏诊、误诊，降低患者病死率。