乳腺癌循环肿瘤细胞检测的临床应用

谢建栋 综述 熊 斌,2△ 审校

(1济宁医学院临床医学院，济宁 272013;2济宁医学院附属医院，济宁 272029)

根据最新的全球癌症统计显示[1]，全世界癌症的发病率和死亡率持续上升，女性乳腺癌已经超过肺癌成为最常见的癌症类型，死亡率位居第五。乳腺癌患者的死亡与远处转移的发生率密切相关，转移和复发往往会使癌症患者难以治愈，走向死亡。这种转移的发生发展由循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)所介导，这种由恶性肿瘤排出能够侵入周围组织并进入淋巴及血液循环的肿瘤细胞，会在全身其他组织和器官部位建立新的转移，最终造成患者死亡[2]。因此，CTC在乳腺癌转移过程中发挥着重要作用。

1 CTC

1869年，澳大利亚Ashworth教授[3]通过观察1例转移性癌症患者的外周血，首次发现了一种细胞，其形态与原发肿瘤相似，故将其命名为CTC。目前，CTC定义为自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周循环的肿瘤细胞。CTC自肿瘤脱落后进入血液，由于受到机体免疫系统的攻击，其半衰期在1～2.5h。然而，少数存活CTC可引起远处转移性疾病[4]。血液中的CTC相对于其他血细胞(如白细胞、红细胞)来说较少，106～107个白细胞中可能仅有1个CTC。CTC可以单独或成簇地在血液系统中循环，CTC簇很少见，但它们比单个CTC具有更大的发生远处转移的能力[5]。CTC存在不同类型，包括上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮细胞与间质细胞混合表型，这是由于肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中会发生上皮-间质转变(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。在EMT中，原本应分化为上皮组织的细胞失去了原有分化方向，反而获得间充质细胞特性和能力，具有更强的迁移和侵袭能力[6]。CTC可以与中性粒细胞结合，这种中性粒细胞和CTC之间的相互作用促进了细胞周期的进展，增加了CTC的转移潜力，使患者的无进展生存期(progress free survival,PFS)成倍的缩短[7]。

2 CTC检测方法(富集和鉴定)

2.1 基于物理特性的富集

基于物理特性可以快速分离CTC而无须进行复杂的标记。代表检测方法包括：利用密度差异的密度梯度离心法，利用细胞大小差异的膜滤过分离肿瘤细胞技术(ISET)，利用介电性质差异的介电泳场流分离(DEP-FFF)，利用变形性差异的微流分离平台[8]。基于物理特性的分离技术提供了高通量富集的可能，但由于CTC的大小和异质性，目前的技术存在很大的局限性。

2.2 基于生物学特性的富集

基于生物学特性主要使用针对肿瘤相关抗原(阳性富集)或共同白细胞抗原CD45(阴性富集)抗体的免疫学方法。阳性富集通常采用抗上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)的抗体。EpCAM是上皮源性癌症的常见标记蛋白，而白细胞不表达[9]。在目前基于EpCAM的技术，自动化Cell Search®系统能够可靠地检测血液中的CTC，适用于临床实验室对转移性乳腺癌患者的常规评估[10]。过去10年，使用EpCAM检测癌症患者血液中CTC的方法数量有所增加，例如 Magsweeper、MACS、Strep-Tactin、CTC-Chip和GO芯片。但面对EMT的CTC，由于EpCAM是阴性的，不能通过抗EpCAM抗体的检测来分离，面临着这一部分的CTC的丢失。阴性富集通常是通过靶定CD45去除白细胞，使CTC被富集沉淀。近年来用于分离CTC的EPISPOT(epithelial immunospot)技术就是采用的此种方法，虽可以获取全部特征的CTC，但面临着纯度方面的问题。

2.3 细胞鉴定

CTC分子检测方法包括利用荧光原位杂交(FISH)检测基因组扩增，免疫细胞化学(ICC)检测蛋白质标记物，RT-PCR/qRT-PCR检测特异性RNA和DNA序列，可以鉴定CTC。

3 CTC计数在乳腺癌中的临床应用

3.1 在转移性乳腺癌(metastatic breast cancer,MBC)中的应用

Cristofanilli等[11]对177名MBC患者采用Cell Search系统行CTC计数检测，发现CTC≥5个/7.5ml血液相较于CTC<5个/7.5ml血液的PFS和总体生存期(Overall survival，OS)更短，证明了CTC在疾病期间具有预后价值。低水平CTC比高水平CTC的PFS和OS明显增加，说明在MBC治疗进程中任何时间CTC的升高提示病情可能恶化[12]。Larsson等[13]的一项前瞻性研究纳入了156名首次诊断为MBC女性患者6个月的CTC和CTC簇的动态监测。从所有研究时间点来看，CTC计数升高、≥5 CTC和CTC簇的检测均可预测预后，随着时间的推移，预后价值增加。这表明CTC水平的动态变化与预后的相关性比仅基线计数更重要。此外，与简单的CTC计数相比，CTC簇的存在增加了更重要的预后价值。监测接受全身治疗的MBC患者血液中的CTC和CTC簇可能会提供有关终点临床结局的重要预后信息。MBC患者死亡率与CTC簇无关，而是取决于CTC的数量。CTC 是疾病IV期患者分层的理想选择。IV期惰性患者(<5CTC)的OS比IV期侵袭性患者(>5CTC，36.3个月vs 16个月) 更长，与疾病亚型无关。因此，CTC计数可作为晚期疾病分期和疾病分层的重要工具。

3.2 在早期乳腺癌中的应用

相较于MBC，CTC在早期乳腺癌中的临床价值受到限制，主要由于CTC在非转移性乳腺癌中尤为罕见，通常发现少于1个CTC/10mL血液，其中5个或更多CTC是罕见事件(1%～5.9%)。使用比MBC(每 7.5mL血液≥5个CTC)更低的阈值(每7.5mL血液≥1个CTC)在诊断时，约20%至25%的非转移性乳腺癌患者可检测到CTC[14]。与MBC类似，CTC可以提供独立的预后信息[15]。最近的国际荟萃分析(IMENEO研究)[14]基于来自16个中心接受新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy，NCT)治疗的2000多名早期乳腺癌患者，结果显示CTC计数是无远处转移生存、OS和局部复发的强有力且独立的预后指标。重要的是，对生存的影响与检测到的CTC的数量有关，随着CTC数量1个到5个或更多，死亡风险比显著增加。该研究表明CTC计数是NCT治疗的早期乳腺癌患者的独立和定量预后因素。Goodman等[16]的一项回顾性研究表明，早期乳腺癌患者手术后的CTC检测可预测辅助放疗的益处。这表明CTC计数可用于指导临床医生确定哪些患者将从放射治疗中受益。Trapp等[17]研究发现化疗两年后CTC的存在与无病生存期(DFS)和OS降低有关。证实了CTC可以作为化疗后乳腺癌常规随访期间的预后监测标志物。而在新辅助化疗方面，Gwark等[18]研究发现NCT后有未达到病理完全缓解(pCR)和CTC≥5的患者显示出具有较差的OS。Spring等[19]荟萃分析在NCT后实现pCR可显著改善乳腺癌患者PFS和OS，特别是对于三阴性乳腺癌和HER-2阳性的乳腺癌。Ni等[20]研究发现CTC计数随NCT的应用而减少，术前CTC阳性而NCT后转为阴性的CTC患者的pCR比率高于其他组。但O'Toole等[21]研究显示在pCR的患者中，NCT后CTC仍然存在，这一发现表明CTC计数可能不适合替代病理学评估新辅助化疗的效果。在一项前瞻性试验Treat-CTC[22]中，63名在新辅助化疗和手术后患有非转移性HER-2阴性乳腺癌且可检测到CTC的患者被随机分配至曲妥珠单抗(赫赛汀)或观察组。试验的主要终点第18周CTC计数没有差异，试验因无效而停止。这种阴性结果可能与CTC的HER-2状态有关，因为在研究中不要求CTC必须是HER-2阳性。事实上，大多数患者(76%)CTC呈阳性。Treat-CTC试验的失败与选择不适当的治疗干预有关，不能够说明基于CTC变化的治疗决策是无效的。

4 CTC分子分析在乳腺癌中的临床应用

随着CTC检测的进步，除了计数之外，从患者血液中有效分离出的CTC可以进行详细的分子分析，包括检测遗传和表观遗传变化、表达谱和表型筛选。近年来，CTC的单细胞测序已得到广泛研究，能够揭示CTC的基因组和转录组。CTC表型是治疗反应的另一个重要预测因子。CirCe T-DM1研究[23]是第一个不使用CTC数量而是表型作为决策标准的临床试验。共筛选了155名患者，14名(9.0%)患有HER-2阳性CTC，11名患者接受了TDM-1治疗。仅在一名患者中观察到部分反应。由于这些结果以及HER-2阳性CTC的患病率非常低(占检测到的CTC的1.6%)，结论认为，所测试的治疗方法没有前景。Guan等[24]研究得出使用总CTC计数和间充质CTC比例的联合指标在HER-2阴性转移性乳腺癌患者的预后评估和疗效监测中较单纯地使用总CTC计数具有更高的敏感性。CTC表型表现出很大的动态变化趋势，这与治疗反应的变化有关。这种基于EMT标志物的简单实用的CTC检测方法可以实现对治疗反应的动态监测，并可能对MBC个性化治疗做出很大贡献。MBC患者大多数CTC为ER、PR阴性，而原发性肿瘤却为阳性。这可能反映了一种逃避内分泌治疗的机制。与此相反，在ER、PR阴性乳腺癌中，原发性肿瘤和CTC之间受体状态的变化通常很小。Papadaki等[25]研究证实在那些患有MBC且对治疗方案没有反应的患者中，化疗后上皮细胞与间质细胞混合表型人群增加了，此亚群是PFS降低的独立预测因素，在HER-2阴性患者中，它也可预测OS降低。深入分析CTC的分子分型有助于理解肿瘤的转移机制和耐药机制[26]。理想情况下，CTC下游分子表征的改进将最终导致针对乳腺癌转移过程的定制药物的开发。Wang等[27]测量了105名HER-2阴性的MBC患者的CTC的HER-2 表达，结果说明了CTC在检测HER-2不一致和预测对HER-2靶向治疗的反应方面的潜在效用。

5 小结与展望

CTC检测目前主要应用在乳腺癌的早期诊断、预后评估、复发转移监测、疗效评价及肿瘤的个体化治疗等方面。尤其是CTC的定量和定性检测已被应用于快速评估化疗和靶向治疗的疗效、预测预后、实时监测治疗耐药和癌症复发。在CTC的分子检测和表征方面也取得了相关进展，但是我们对CTC功能特性的知识仍然有限，应用仍然主要局限于研究目的和临床研究，仍然缺乏临床有效性的证据，尤其是临床实用性方面。在检测技术方面，虽然目前的CTC分离技术和产品种类繁多，很多开发的新技术显著提高了CTC检测的灵敏度和计数的准确性，但仍面临着众多的CTC检测技术无法进行评估和相互比较的问题，仍需寻找灵敏度和特异度更高的检测方法，以及对检测标准进行相统一。这需要在分析前阶段对样本处理进行标准化程序，或建立CTC分子分析的可重复工作流程。总之，关于CTC在转移过程中的生物学机制和临床影响，以及更深层次的认识和了解，还有待进一步的研究。