非小细胞肺癌来源外泌体的免疫效应和潜在生物标志物

贾俊斌 顾岩,2

据2018年全球肿瘤统计分析报告显示，肺癌是全球发病率和致死率最高的恶性肿瘤[1]。肺癌病理分类为非小细胞肺癌(Non-Small-Cell Lung，NSCLC)和小细胞肺癌(Small-Cell Lung，SCLC)，其中NSCLC是最常见的病理组织学类型，包括腺癌、鳞状细胞癌,大细胞癌和鳞腺癌等，占到所有肺癌的85% , 其5年生存率仅为16%[2]。NSCLC早期时缺乏典型临床症状，不易被察觉，多数的NSCLC患者确诊时已处于晚期，预后较差。尽管肺癌治疗的方法不断在进展，除传统的手术、放疗、化疗外，本世纪初，针对驱动基因阳性靶向治疗的问世，显著延长了患者的总生存期，但其远期疗效仍有待提高，目前，免疫检查点抑制剂(ICIs)已被用作晚期NSCLC的一线治疗药物，其具有代表性的PD-1/PD-LI单抗，能够抑制肿瘤应答T 细胞表面的PD-1受体与肿瘤细胞表面的PD-L1配体结合，再次激活T细胞，发挥杀死肿瘤细胞的作用。ICIs被批准用于肺癌的治疗为NSCLC患者带来了新的希望，且取得了突破性的进展，但仅约20%患者在接受治疗后获得了长期疗效,且多数患者后期复发，预测免疫治疗疗效生物标志物的不足与肿瘤免疫微环境的复杂和免疫逃逸，是导致疗效不理想的重要原因。近年研究表明，肿瘤源性外泌体(tumor-derived exosome，TEX)对肿瘤发生、肿瘤生长、信号转导和进展有巨大的影响。它们在细胞间通信和在癌细胞与周围细胞之间运输丰富的小分子和信号分子(组成肿瘤微环境(TME)中发挥重要作用[3-4]。因此探究非小细胞肺癌来源外泌体的免疫效应，对NSCLC免疫治疗的作用变得至关重要，本综述主要对非小细胞肺癌来源外泌体参与NSCLC肿瘤免疫微环境中的作用和潜在生物标志物探索的近年研究进展进行归纳综述。

肿瘤源性外泌体简介

细胞外囊泡通常分为两类，即胞外体和外泌体，胞外体是由质膜直接向外出芽产生的囊泡，可以产生微囊泡、微粒和大囊泡，直径范围为50nm～1000nm，外泌体起源于核内体，由脂质双层膜组成，直径范围为40～160nm(平均100nm)。外泌体的产生过程包括质膜的双重内陷和细胞内多泡体(multivesicular bodies，MVBs)的形成，其中包含腔内小泡(intraluminal vesicles，ILVs)，通过MVB与质膜融合和胞外分泌，ILVs最终作为外泌体分泌[5]。外泌体包含膜蛋白、胞质及核蛋白质,细胞外基质蛋白,代谢物,核酸,即mRNA、非编码RNA和DNA[6-7]，可反映它们的来源细胞。外泌体是细胞间通讯的中介，与免疫反应、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中枢神经系统相关疾病和癌症进展相关[5]。肿瘤与免疫相关研究成为热点领域，源自肿瘤细胞分泌的外泌体，称为肿瘤源性外泌体(TEX)，同样拥有上述结构和遗传特性。肿瘤源性外泌体是肿瘤细胞与宿主细胞之间细胞内通讯的主要机制，使肿瘤细胞能够调节周围环境，为肿瘤的发生和发展创造最佳的微环境[8]；Weidle和 Lobb的研究表明肿瘤源性外泌体在肿瘤转移前微环境的形成及转移过程中起着重要的中介作用[9-10]；同时肿瘤源性外泌体含有多种免疫刺激和免疫抑制因子，通过影响受体细胞的基因表达和信号通路来调节肿瘤微环境的免疫反应参与细胞的重编码，在多种类型癌中被证明：如晚期宫颈鳞状细胞癌细胞分泌的外泌体将miR-142-5p传递给淋巴内皮细胞，并通过ARID2-DNMT1-IFN-γ信号通路诱导吲哚胺2,3-双加氧酶表达，从而抑制和消耗CD8(+) T细胞[11]调节肿瘤免疫微环境，胰腺癌来源的外泌体miR-212 3p下调树突状细胞中MHC-Ⅱ转录因子RFXAP(调控因子X相关蛋白)，可能促进癌细胞的免疫逃逸[12]。因此肿瘤源性外泌体与肿瘤免疫微环境密切相关，近年来非小细胞肺癌(NSCLC)来源外泌体的研究也得到了广泛重视。

NSCLC来源外泌体在肿瘤免疫微环境中的作用

肿瘤微环境是指肿瘤或癌症干细胞存在的细胞环境，包括周围的免疫细胞、血管、细胞外基质、成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓源性炎症细胞和信号分子[13]。随着肿瘤与宿主之间免疫反应的研究，对肿瘤微环境中免疫环境(肿瘤免疫微环境)多样性和复杂性有了进一步认识，可能影响肿瘤的发生和治疗[14]。

一、NSCLC来源外泌体参与免疫细胞的调节

NSCLC免疫治疗的抗肿瘤作用是免疫细胞与肿瘤细胞相互作用的结果，而NSCLC来源的外泌体对免疫微环境中多种免疫细胞有直接或间接的影响。在肿瘤微环境中，树突状细胞促进肿瘤的发生起重要作用，将肿瘤细胞释放的抗原提呈给免疫效应细胞，有研究指出肺癌活检分离出的外泌体中，大约80%含有表皮生长因子受体(Endothelial Growth Factor Receptor，EGFR)， EGFR具有诱导耐受性树突状细胞和调节性T细胞的潜力，最终导致肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的抑制,[15]造成肿瘤免疫逃逸。巨噬细胞可被肿瘤细胞分泌的某些因子驯化，成为免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAM)，在肿瘤进展过程中，循环的单核细胞和其他炎性淋巴细胞被招募到肿瘤组织中,改变肿瘤微环境。单核细胞是TAM的前体，能够在炎性肿瘤微环境中持续生存并产生TAM[16]。肿瘤源性外泌体在单核细胞存活和肿瘤炎性微环境内TAM生成中具有关键作用[8]，在NSCLC患者的TAM分泌TNFα促进肿瘤细胞糖酵解，增加腺苷酸激活蛋白激酶和过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子1- α促进肿瘤缺氧[17]，可能阻碍抗PD-L1治疗NSCLC的疗效。肿瘤细胞上表达的PD-L1与免疫细胞上的PD-1受体结合时，这种相互作用导致细胞毒性CD8+T淋巴细胞的增殖、存活和效应功能受到抑制，从而诱导肿瘤浸润T细胞凋亡。最新的研究表明NSCLC分泌的含PD-L1的外泌体可能通过PD-1/PD-L1相互作用调节T细胞中的IFN-γ信号通路从而抑制T细胞的活性和促进肿瘤细胞的生长[18]。

二、NSCLC来源外泌体调节微环境促进肿瘤的发展和转移

上皮间充质转化(Epithelial MesenchymalTransition，EMT)是上皮细胞获得间充质细胞特性的过程，使细胞具有侵袭性。从晚期NSCLC患者血清中分离出的TEX，与高度转移的癌细胞一样，含有高水平的波形蛋白，并可诱导受体人支气管上皮细胞发生EMT[19]从而导致肿瘤的转移和发展。NSCLC的TEX对肿瘤血管的生成以及转移前微环境的形成起重要作用，金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1表达在肺癌的所有分期和类型中都升高，特别是在肺腺癌中，在PI3K/Akt/HIF-1通路的控制下，过表达TIMP-1可诱导肺腺癌细胞及其分泌的外泌体中致瘤miR-210的表达，而这些表达miR-210的TEX下调了内皮细胞(ECs)中的促红细胞生成素肝细胞受体配体A3(EphrinA3)，促进血管生成[20]。非小细胞肺癌源性外泌体的微小RNA(MicroRNA,miRNA)通过选择性靶向和激活肺上皮细胞中的TLR3促进癌细胞转移前生态位的形成，这导致了增强的趋化因子分泌和随后的中性粒细胞募集到肺，共同促进转移前微环境的形成[21]。因此，NSCLC源性外泌体对调节肿瘤免疫微环境，介导肿瘤发生发展、转移及免疫逃逸，发挥重要作用，这可能是造成NSCLC的免疫治疗特异性差的重要原因。

NSCLC来源外泌体有成为NSCLC免疫治疗生物标志物的潜力

ICIs在NSCLC治疗取得了良好疗效，对于预测免疫治疗疗效的生物标志物，以更好选择合适的患者获得长久疗效方面，仍需要进一步研究，目前用于预测NSCLC免疫治疗疗效的主要生物标志物有肿瘤组织PD-L1的表达和肿瘤突变负荷(TMB)，但各有其不足[22]，且与疗效的相关性并不高。肿瘤源性外泌体携带蛋白质和核酸等物质，与肿瘤细胞性质关系密切，参与肿瘤细胞与宿主细胞的相互交流，越来越多的证据表明肿瘤源性外泌体内容物，有可能成为新的预测免疫治疗疗效的生物标志物[23]。肿瘤源性外泌体miRNA和PD-L1，在肿瘤免疫微环境的独特性使得其得到广泛关注与重视。

一、NSCLC来源外泌体miRNA的表达

非编码RNA (Non-coding RNAs, ncRNAs)是一类不能被翻译成蛋白质的功能性RNA分子。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一类特征明确的长约22nt的ncRNAs ，可以调节mRNA的表达,通常通过结合转录后 3′-非翻译区 (3′-UTRs)来调节其靶基因的表达，大量研究表明miRNA可能成为肺肿瘤新的生物标志物[24]，以及对治疗有潜在价值。miRNA在肿瘤源性外泌体中表达丰富，用于NSCLC早期诊断及预后已被大量研究。部分外泌体miRNA与肺癌患者PD-L1的表达相关，影响肿瘤的治疗，如肿瘤源性外泌体miR200b低表达与NSCLC患者预后不良有关，在NSCLC患者标本中，miR200b与PD-L1的表达呈负相关，miRNA-200b可能是肺癌患者PD-L1表达的潜在生物标志物[25]，PD-L1的表达仍是临床常用的预测疗效的常用指标，miRNA-200b可能成为预测NSCLC免疫治疗疗效的一种辅助因子。NSCLC源性外泌体miRNA可能通过调控肿瘤免疫微环境，影响肿瘤的发生和发展，有研究指出非小细胞肺癌来源的低表达miR-34c-3p的外泌体，通过上调整合素α2β1促进非小细胞肺癌的侵袭和迁移[26]。Kim等研究指出非小细胞肺癌中，肿瘤中RCAN1.4的表达水平明显低于正常肺组织，miR-619-5p的表达水平明显高于正常肺组织，肿瘤来源的外泌体miR-619-5p通过抑制RCAN1.4促进肿瘤血管生成和转移[27]。推测这些肿瘤源性的外泌体miRNA在正常组织与肺癌组织中表达差异，较大影响肿瘤的进展，可能会导致NSCLC治疗疗效及预后不良，很有可能成为新的生物标志物。

二、NSCLC来源外泌体PD-L1的表达

部分PD-L1阳性表达的NSCLC患者并没有从免疫治疗中获益。导致这种令人失望的治疗反应的原因尚不清楚，但可能是肿瘤微环境中PD-L1驱动通路的综合机制，包括循环PD-L1的意义尚未完全了解。新的研究表明多种肿瘤细胞分泌的外泌体表达PD-L1已被证实，如黑色素瘤、前列腺癌、小鼠肿瘤细胞系等[28-30]，参与肿瘤免疫抑制调节通过抑制T细胞活性促进肿瘤生长，与抗PD-L1/PD-1治疗耐药性相关。在NSCLC中肿瘤源性的外泌体表达PD-L1也已被证实，并且这些外泌体参与肿瘤进展[18,31]。此外，PD-L1存在于从NSCLC患者血液中分离出来的外泌体上，PD-L1表达阳性的外泌体通过抑制细胞因子和诱导CD8+T细胞凋亡在肿瘤免疫逃避中比肿瘤相关组织PD-L1发挥更重要作用[18]。另一研究也指出在NSCLC患者，特别是晚期NSCLC患者的Exo-PD-L1(21.10±11.63 pg/mL 血清)水平高于健康对照组(15.91±6.45 pg/mL 血清)，此外，在NSCLC患者中，较高的Exo-PD-L1含量与肿瘤大小、阳性淋巴结状态、远处转移和TNM晚期相关，而肿瘤组织免疫组化PD-L1的表达仅与吸烟状态与组织学亚型显著相关[31]，这可能解释了PD-L1免疫组化表达量预测抗PD-L1/PD-1治疗NSCLC疗效差的原因，这也为肿瘤源性外泌体PD-L1作为抗PD-L1/PD-1治疗新的预测因子提供理论依据。关于肿瘤源性外泌体PD-L1预测疗效，已有临床相关研究，Del等通过PCR检测黑色素瘤和肺癌血浆源性外泌体PD-L1 mRNA观察与对nivolumab 和pembrolizumab应答的关系发现血浆源外泌体中PD-L1 mRNA的表达与黑色素瘤和非小细胞肺癌中抗PD-1抗体的应答相关[32]。近期Shimada等在对120例肺癌患者随访过程中，发现肺癌患者血清源性外泌体PD-L1≥166 pg/mL与CD8+T细胞数量的增加(P=0.014)和肿瘤表面PD-L1阳性(P=0.031)显著相关，在17例复发肺癌患者接受PD-1抑制剂治疗，PD-1抑制剂包括9种派姆单抗单药方案、6种尼鲁单抗单药方案和2种联合免疫治疗方案中，所有血清源性外泌体PD-L1≥166pg/mL的患者对PD-1抑制剂均有疾病控制作用[33]。

NSCLC来源外泌体在免疫治疗方面的潜在价值

肿瘤源性外泌体的生物学特性使它们在NSCLC的免疫治疗方面有潜在的价值。肿瘤来源的外泌体在肿瘤微环境中往返于肿瘤和免疫细胞，提供肿瘤特异性抗原，是很有希望的抗癌疫苗候选体，参与肿瘤的免疫治疗[22]。Besse[34]等一项研究表明了树突状细胞来源外泌体用于NSCLC一线化疗后免疫维持治疗的价值，证实了树突状细胞外泌体疫苗的可行性。NSCLC来源外泌体参与肿瘤的免疫调控，影响NSCLC的免疫治疗，主要包括免疫抑制和免疫激活两个方面。Liu[35]等研究指出，在NSCLC中，肿瘤源性外泌体microRNA-433通过增加CD4+T和CD8+T细胞的浸润抑制肿瘤的发生，肿瘤浸润性CD8细胞与肿瘤免疫治疗效应密切相关，其可能是增强免疫治疗的关键因子；多项研究也表明NSCLC来源外泌体PD-L1与肿瘤免疫治疗疗效差和预后不良相关，肿瘤源性外泌体PD-L1可能与免疫检查点抑制剂耐药相关[18,31-32]，可能是免疫治疗的新靶点。在晚期NSCLC患者中，装载有IFN-γ、MHCⅠ和MHCⅡ限制性癌抗原的树突状细胞外泌体增强NK细胞的抗肿瘤免疫功能[34]；另一方面，肿瘤源性外泌体可以调节肿瘤微环境中的抗炎信号，从而有效提高肺癌免疫治疗的疗效[36]，因此通过阻断或促进相关肿瘤源性外泌体释放有利于优化肿瘤微环境的抗肿瘤免疫反应，增强免疫治疗的疗效。总之，NSCLC来源外泌体参与肿瘤免疫调控，影响肿瘤免疫治疗，NSCLC源性外泌体miRNA和PD-L1可能是一个尚未探索的免疫治疗靶点，这可能是克服当前免疫治疗耐药性的突破口，也为NSCLC的治疗开创了新思路。

总结与展望

在正常和病理条件下，外泌体介导细胞与其周围环境之间信息交流。肿瘤源性外泌体作为肿瘤细胞与肿瘤免疫微环境之间的重要沟通机制，在肿瘤的进展和转移中发挥着重要作用。随着对NSCLC来源外泌体，在肿瘤免疫微环境中调控机制的研究，人们越来越清晰NSCLC来源外泌体在肿瘤发生发展中的重要性。迄今为止很多数据表明NSCLC来源外泌体有成为NSCLC免疫治疗新的预测疗效生物标志物的潜力，用单一的NSCLC源性外泌体miRNA/PD-L1预测疗效可能存在一定异质性，可将敏感性及特异性较高的一组肿瘤源性外泌体与现有生物标志物结合更好将NSCLC患者分层对于指导治疗及预后可能会有突破性的意义。随着对NSCLC源性外泌体免疫效应与分子机制研究的不断完善，NSCLC来源的外泌体也可能会成为一种新的免疫治疗手段，但肿瘤源性外泌体的使用有一些局限性，如它们的分离、纯化和鉴定方法的复杂性，以及其异质性，但是随着技术的进步以及完善不是其发展的主要阻碍。然而，要将基于外泌体的技术转化为临床应用，还需要更复杂的临床研究来解决目前外泌体生物学的局限性。随着NSCLC来源的外泌体在免疫效应以及生物标志物方面的进一步探索，对NSCLC的治疗有巨大的潜在价值。