循环微小RNA可作为ARDS生物标志物的研究进展

邱小宇 王晓芝 黄潇

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是以进行性呼吸困难和顽固性低氧血症为临床特点的急性呼吸衰竭综合征，发生在严重感染、休克、外伤、烧伤等疾病过程中，是急性肺损伤(ALI)的一种严重形式，在世界范围内引起了大量的发病率和死亡率,最近的一项系统回顾表明，急性呼吸窘迫综合征的死亡率在36～44%之间[1-2]。近年发现，微小RNAs作为一种新的基因调控分子，在包括ALI在内的多种复杂疾病中发挥着重要作用[3]，且越来越多的证据表明，miRNAs与ALI/ARDS的发病机制有关。本文通过总结国内外的相关研究，阐述miRNAs作为ARDS生物标志物的研究进展，也对miRNAs在ARDS中的作用机制作进一步探究与展望。

ARDS

一、ARDS的病理生理过程

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是指由多种肺内或肺外因素引起的，以进行性呼吸困难和顽固性低氧血症为临床特点的急性弥漫性肺损伤，因高病死率而备受关注。作为严重的急性肺损伤，其发病进程常伴随高水平促炎因子的释放，造成中性粒细胞大量涌入，破坏肺泡-毛细血管屏障，增加肺血管通透性，导致弥漫性肺泡损伤、肺泡表面活性物质功能障碍及肺水肿[4]，进而导致呼吸衰竭。ARDS的病理生理过程可分为三个阶段：渗出期，增生期，在没有恢复的情况下，一些患者可能会由前两期发展为纤维化期，正常内皮-上皮屏障功能障碍在上述进程进程中有其重要作用。

二、ARDS早期诊断

虽然目前针对ARDS的治疗已经取得重大研究进展，但早期诊断的困难和复杂的疾病进程，使ARDS患者的死亡率仍高达40%左右[5]，且许多幸存患者患有呼吸困难等并发症[6-7]。早期识别诊断ARDS，预测ARDS的预后，有助于确定新的治疗和干预目标，是提高患者生存率，改善生存状况的关键。因此，寻找早期诊断及与预后相关的生物标志物，显得尤为重要。

理想的生物标志物应表明与疾病病理生理事件存在明确关系，需要具备可靠性、可重复性、疾病特异性和敏感性的特点，并且需要取样简单、相对便宜、浓度几乎没有昼夜变化等优点[8]。针对ARDS生物标志物的检测，主要来源于患者呼出的呼气冷凝液、尿液、血液或血浆(血清)、支气管肺泡灌洗液(BALF)或气管抽吸物，单个标记物水平的增加或降低可能表明特定类型的细胞损伤或激活。

目前已发现与ARDS疾病进程相关的生物标志物有可溶性糖基化终产物受体(sRAGE)、特异性表面活性蛋白(SP)、膜糖蛋白KL6、血管性血友病因子(vWf)、可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)、E-选择素(CD62E)、血管生成素1(Ang-1)和血管生成素2(Ang-2)、高迁移率族盒核蛋白(HMGB)、脂多糖结合蛋白(LBP)、尿激酶抑制剂纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)、角质形成细胞生长因子(KGF)和肝细胞生长因子(HGF)，以及相关炎症介质，如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素10(IL-10)等。近年研究发现，微小RNAs(miRNAs)可以稳定存在于人外周循环中，且在不同疾病状态下呈现差异表达[8]，部分miRNAs可用于ARDS的严重程度或预后的判断。

MicroRNAs特性

MicroRNAs(miRNAs)是一种非编码短链RNA分子，长度约为19到25个核苷酸[9]，在真核生物中广泛存在。成熟MiRNAs通过与信使核糖核酸(mRNA)特异结合，从而抑制转录后基因表达，在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序等方面起重要作用。近年研究发现，miRNAs在包括心血管疾病、肾脏疾病、糖尿病和肿瘤在内的多种人类疾病中显示出调节潜力。在肺部疾病方面，已有研究表明miRNAs同哮喘、炎症、纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、ARDS等疾病相关[10]。作为外泌体的一员，miRNAs可在人血清或血浆中稳定表达，且在不同贮藏条件下具有稳定性[11]，在存在有害刺激的情况下，血液中miRNAs的组成可以改变，使它们成为生物标志物的绝佳候选物。MiRNAs可以从细胞、组织和体液中分离出来，如血清、血浆、眼泪或尿液[12]，检测miRNAs的传统方法包括northern印迹法、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(QRT-PCR)、微阵列法等[13]。在ARDS/ALI患者中，某些miRNA表达发生了变化，这些变化的miRNAs通过靶向特异性分子，减少过度免疫反应，抑制细胞损伤并加速疾病的恢复[14]。因此，miRNA被提出作为ARDS/ALI的潜在生物标志物和治疗靶点。

MicroRNAs作为ARDS早期诊断和预后及相关机制的研究

现将目前已证实的与ARDS诊断及预后相关的部分miRNAs及其潜在的调控机制总结如下。

一、MicroRNAs在ARDS早期诊断和预后中的价值

已有临床研究发现，在ARDS进程中，一些miRNAs表达异常，并通过调控mRNA转录和表达，参与整个发病过程。

在Gennaro Martucci等人报道[15]的一项临床研究中，将754例ARDS患者根据疾病的严重程度(SAPSⅡ、SOFA评分、RESP评分)分为两组：高严重程度组(A组)和低严重程度组(B组)，用高通量定量聚合酶链反应筛选出13种miRNA。特别是，高严重程度(A组)的ARDS患者与低严重程度(B组)的ARDS患者相比，miR-93，-99a，-92a，-212，-20a，-19b，-18a，-17，-126，-19a和let-7a显著上调。这表明，一些miRNAs可用ARDS严重程度的判断。

由于脓毒症引起的ALI/ARDS，是脓毒症严重时所致多器官功能障碍的肺部表现，与脓毒症的进展休戚相关。Andrew J. G.等[16]在临床研究中，检测出了严重脓毒症患者血浆中(入院24小时内)miRNAs的表达水平，并评估了差异表达的miRNAs与休克和器官衰竭发展之间的关系。进一步研究发现，血浆miR-15a、-27a和-34a表达水平的改变与严重脓毒症患者休克的发展相关，其中miR-15a是区分脓毒症患者有无休克的最具预测性的单一miRNA，AUC(Area Under Curve，ROC曲线下与坐标轴围成的面积)为0.7(95%可信区间为 0.57～0.84)[16]。因此，检测脓毒症患者血浆中miR-15a、-27a和-34a的表达水平，对于ARDS的早期诊断以及判断ARDS的严重程度有重要意义。

为评估miRNAs对ARDS/ALI预后的影响，HanYan等人[17]进行了一项临床实验，该实验纳入了244例由脓毒症导致ALI的患者(44例严重脓毒症、102例脓毒症)和19例健康志愿者。严重脓毒症诱导的ALI或ARDS患者的APACHE Ⅱ评分、30天死亡率和无创呼吸机天数均显著高于脓毒症患者。QRT-PCR结果显示，与对照组相比，严重脓毒症和脓毒症诱导的ALI患者血浆中miR-155和miR-146a相对浓度显著升高。随后，对26例miR-155和miR-146a显著升高的患者进行随访，其中18例(69.2%)和16例(61.5%)患者的miR-155和miR-146a的值分别有显著降低，提示这两个标记物的峰值出现在ALI最严重的时期。通过ROC曲线来评估miR155和miR-146a的表达值，以预测30天死亡率。结果表明miR-155和miR-146a预测脓毒症患者30天死亡率的AUC分别为0.782和0.733，略低于APACHE Ⅱ评分的0.835 (P<0.05)[17]。以上研究结果表明，miR-155和miR-146a可能作为严重脓毒症和脓毒症诱导的急性肺损伤患者预后的生物标志物。

二、miRNAs参与ARDS进程相关机制的研究

ARDS的发展有几个重要的病理生理过程，包括炎症、免疫调节失调和肺内皮细胞和上皮细胞通透性增加[18]。miRNAs作为ARDS潜在生物标志物和治疗靶点,从以下几个方面参与ARDS进程。

1 ARDS肺内屏障破坏与miRNAs：ARDS肺内屏障(包括内皮屏障和上皮屏障)的功能障碍，引发肺水肿和进一步呼吸衰竭的发生。这主要是由血管内皮多糖包被(GXG)和紧密连接(TJ)蛋白破坏引起的[19]。血管内皮多糖包被(GXG)是覆盖在血管内皮表面带负电荷的一层多糖-蛋白质复合物，是内皮细胞的第一道屏障，通过尺寸选择性、空间位阻和静电斥力保护血管内皮细胞，在维持血管内皮通透性方面起着重要作用[20-21]。紧密连接(TJ)是由多个链接复合体形成的防止渗透的屏障，TJ蛋白由跨膜蛋白如封闭蛋白、连接粘附分子和细胞质蛋白如小带封闭蛋白(ZO)-1、ZO-2和ZO-3组成，是上皮屏障功能最关键的决定因素[22]。因此GXG和TJ蛋白的损伤是导致血管内皮和肺泡上皮通透性增加的重要因素[23]。已有研究发现某些miRNAs与GXG、TJ蛋白具有相关性。

MiR-143最早被发现于对脂肪细胞分化的调节作用，其水平在分化的脂肪细胞中增加，抑制其水平有效抑制脂肪细胞分化[23]。后续研究发现它的表达失调参与了结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、骨肿瘤、脓毒症多种疾病的病理生理过程。

Boris Schmitz等研究者[24]以健康青年为研究对象，探讨了高强度间歇训练(HⅡT)对微血管参数(包括GXG厚度和相关miRNAs)的影响，结果发现最大运动能力与微血管GXG厚度呈正相关，而miR-143水平的急性升高可预测GXG厚度增加。进一步对miR-143进行相关研究，发现其作为一种内皮剪切应力依赖性miRNAs，能够诱发内皮细胞产生剪切应力，miR-143感受到剪切应力的刺激释放入血，进而通过调节GXG相关蛋白的表达进而来影响GXG厚度。因此，检测血miR-143水平可判断ARDS患者血管内皮损伤的严重程度，可用于指导ARDS患者的治疗及预后判断。

MiR-126基因定位于表皮生长因子结构域7(EGFL7)基因7号内含子[25]，是一类具有细胞类型特异性的miRNA[26]，对于造血系统、呼吸系统、消化系统、生殖系统及胚胎组织都有一定特异性，但对于心血管系统特异性最高[27]。

ZhouYue等[28]通过气管内注射脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肺损伤，结果发现MiR-126对于ARDS的作用机制是通过内皮祖细胞(EPC)外显体转移到内皮细胞，减少与ARDS发生相关的基因表达来实现。外显体通过促进miRNAs从一个细胞转移到受体细胞，成为细胞间通讯的重要旁分泌机制[29],进一步研究发现，气管内给予EPC外显体可减轻LPS诱导的急性肺损伤[30]。另一项研究对EPCs进行miR-126基因敲除修饰后，发现EPCs外显体功能明显减弱[31]；此外，MiRNA-126-3p和MiRNA-126-5p可显著提高紧密连接蛋白的表达水平，阻止ARDS/ALI相关的上皮紧密连接的丢失，减少上皮屏障功能的破坏[27，32-34]，内皮祖细胞外泌体传递miR-126可提高紧密连接蛋白的表达水平，并维持肺泡上皮屏障的完整性[35]。这些研究表明，miRNA-126减轻LPS所致肺损伤是通过维护肺内屏障来实现。

2 ARDS炎症反应与miRNAs：ARDS进程中伴随高水平促炎因子的释放，形成瀑布式级联反应，炎症介质诱导大量中性粒细胞涌入肺泡腔，引起弥漫性肺损伤。尽管ARDS发病机制尚未完全阐明，但就目前的研究表明，炎症反应是ARDS本质，贯穿ARDS的整个发病过程[36]。

MiR-199a是一种新的基因调控因子，在炎症和肺损伤中具有重要作用[30]，通过调节促炎因子的释放，参与炎症性肺疾病的发展[36-37]。在脂多糖(LPS)诱导的小鼠ALI模型以及LPS处理的人上皮细胞株A549和人巨噬细胞细胞系U937中，miR-199a均发生了显著下调，其下调对LPS诱导的ARDS有促炎作用[38-39]。ChenZhi等人[39]收集了ALI患者的肺组织，通过微阵列分析测量异常表达RNA谱，鉴定出106个差异表达的mrna，结果发现miR-199a-3p在ALI患者肺组织中的表达水平显著下调。因此，miR-199a可作为ARDS检测的生物标志物，其诱导ARDS肺损伤的机制可能是miR-199a水平降低，减少了对下游与促进炎症产生的相关靶点的抑制。

MiR-23参与到了细胞发育的各个阶段，包括细胞的增值、凋亡和变异等。分为两种亚型：MiR-23a和MiR-23b，其中miR-23a与肿瘤、骨骼肌细胞分化、炎症反应、心脏病变等均有密切关联。在急性炎症反应条件下，巨噬细胞通过抑制miR23a的表达，降低IL-6的表达和分泌，从而防止巨噬细胞的过度活化，调节巨噬细胞的免疫功能，减轻机体的免疫损伤[40]。对小鼠的进一步研究发现，脂多糖可激活巨噬细胞中核因子κB通路，并引起miR-23a的表达下调[41]。Cai等[38]通过外源性添加miR-23a类似物到LPS诱导的小鼠和细胞炎症模型中，结果示转染miR-23a组的细胞凋亡率与未转染miR-23a的LPS模型组相比显著降低(P<0.05)，因此发现miRNA-23a的过度表达有改善脓毒症所致肺损伤的作用，随着miRNA-23a的过度表达，肺细胞凋亡和损伤在体内被下调，这一作用可通过抑制PTEN表达和激活AKT磷酸化来实现。因此miR23a可作为预测ARDS肺损伤的生物标记物，其在ARDS治疗与预后方面的价值有待进一步研究。

此外，在LPS等因素刺激的ARDS动物模型及ARDS患者中，miR-214、miR-145、miR-127、miR-146a、miR-127、miR-320等miRNAs的表达上调，miR-127、miR-125b、miR-16、miR-335、miR-499等miRNAs的表达下调[41]。这些miRNAs通过正向或负向参与炎症通路的调节来参与ARDS的炎症反应。

3 ARDS免疫反应与miRNAs：miR-143除影响GXG完整性，也与小鼠肺部脓毒症以及脂多糖(LPS)输注后的人类白细胞败血症有关[42]。脓毒症患者的T细胞呈免疫抑制特征，促炎性miR-150和miR-342下调，抗炎miR-15a、miR-16、miR-93、miR-143、miR-223和miR-424上调；Möhnle P等[43]初步研究确定：miR-143和miR-150可作为检测T细胞免疫抑制的候选标记物，从而有助于开发利用miRNAs作为脓毒症期间免疫功能受损的生物标志物的创新策略。

展 望

近年来，已有越来越多的研究表明miRNAs在ARDS中的广泛作用，既可以作为生物标志物，亦可以作为调节因子参与到ARDS的发生、发展及预后进程中。我们对miRNAs在ARDS中作用的认识仍在不断增加，但miRNAs作为ARDS生物标志物的上调或下调机制仍待阐明。另外，参与调节miRNAs表达的因子或途径众多，miRNAs具体通过哪些因子或途径调控ARDS的病理生理进程仍需探讨。ARDS被认为是一种具有多种病因的复杂综合征，因此一个或几个微小核糖核酸，可能不能为所有ARDS患者提供强信号。最后，目前的研究大多基于细胞或者动物水平，如何应用到临床仍是我们亟待解决的问题。