不可分型流感嗜血杆菌生物膜研究进展

廖丁邦，陈水文，李镇清

(1.暨南大学附属深圳市宝安区妇幼保健院 儿科，深圳 518000；2.南通大学附属医院 胸心外科，江苏 南通 226000)

流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae，Hi)是一类革兰阴性小杆菌，常定植于人类鼻咽部, 以流行性感冒致病菌的身份于1892年被费佛医生发现[1]。直至1933年流行性感冒的病毒性病原被发现后, 误解才得以消除，但它的名字仍保留了“流感”二字。Hi生长要求高，人工培养时需加入血液成分(含血红素Ⅴ或Ⅹ因子)才能生长，故名流感嗜血杆菌[2]。Hi是儿童时期呼吸道感染的重要病原菌，可导致多种感染性疾病(如肺炎、脑膜炎、中耳炎、菌血症等)，和肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌并称中枢神经系统感染的三大致病菌[3]。b型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzaetype b, Hib)曾是Hi侵袭性疾病中最常见的荚膜分型中的血清型，自Hib疫苗接种以来，其发病率显著下降，并且出现了由其他荚膜分型中的血清型(a型、f型)和不可分型(无荚膜)流感嗜血杆菌(non-typeableHaemophilusinfluenzae，NTHi)引起的侵袭性感染[4]。NTHi是儿童最常见的中耳炎病原体之一，NTHi感染占急性中耳炎(acute otitis media, AOM)病因的25%～35%[5]。NTHi与老年人最常见的呼吸系统疾病——慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的发生、进展高度相关[6-7]，是导致 COPD 患者病情恶化的最常见细菌。Hib疫苗广泛使用后，NTHi感染的患者数量越来越多，使NTHi成为Hi感染的主要亚型。

既往对NTHi致病机制的研究呈现出各毒力因子相对孤立的状态。随着对细菌生物膜的深入研究，对Hi致病机制的研究呈现出系统化趋势。NTHi生物膜与细菌蛋白质、菌毛蛋白、脂寡糖(lipo-oligosaccharide, LOS)、环境脱氧核糖核酸(environmental deoxyribonucleic acid，eDNA)、细胞外膜囊泡(outer membrane vesicle，OMV)等密切相关，它们除了协助NTHi定植、黏附、侵袭和免疫逃避外，还可以经过相位变异(phase variation，PV)加速菌株之间基因的流动、信息的交换及营养物质的获取。生物膜是Costerton等[8]于1978年提出的，用于描述附着在生物或环境表面的微生物团块，随后Donlan和 Costerton[9]将生物膜定义为附着在物体表面上的微生物群落。生物膜包括胞外聚合物质(extracellular polymeric substance，EPS)、细菌自溶物质。其中EPS主要由核酸(RNA和eDNA)、蛋白质、糖和脂质等组成[10-11]。DNA结合蛋白II(DNA-binding proteins II，DNABII)通常与 eDNA相关联，并且对于以eDNA作为基质成分的生物膜的结构完整性至关重要[12]。与浮游微生物相比，生活在生物膜中的微生物对恶劣环境的抵抗力要强得多，并且对抗生素的抵抗力更强[13-14]，这主要是由于生物膜中抗生素渗透率有限及细菌代谢率降低[15-16]。除对抗生素的抵抗增强外，生物膜还可以通过降低多形核中性粒细胞和巨噬细胞的作用使宿主产生较弱的免疫反应[17]，有助于细菌的免疫逃避，从而使病原体能够在未被免疫系统发现的情况下渗透到组织中[18]。本文通过对NTHi生物膜的形成及其致病机制的研究现状进行综述，旨在为Hi新型疫苗的研制、抗生素的使用、新型药物的研发提供理论支持。

1 NTHi生物膜的构成及功能

NTHi在体内和体外均可形成生物膜。Langereis等[19]于2013年第一次证明了NTHi在呼吸道形成生物膜的能力。Mizrahi等[20]使用修饰的结晶紫染色确定了NTHi生物膜的形成。有研究表明，NTHi生物膜有助于引起持续的感染[21]。Baddal[22]研究发现NTHi生物膜EPS由DNA、eDNA网络、蛋白质(包括外膜蛋白、DNABII、黏附素等)及LOS等组成。Das等[23]研究表明，Ⅳ型菌毛 (type Ⅳ pili, Tfp) 也是其组成部分。下面将对这些组成部分及功能进行说明。

1.1eDNA及DNABII Devaraj等[24]不仅证实中耳炎栗鼠中耳部分和囊性纤维化患者的痰液中存在eDNA，还表明来自NTHi的DNABII与来自大肠杆菌的DNABII是同系物，它与eDNA中的Holiday交叉结合，从而使3种不同的人类病原体NTHi、大肠杆菌和表皮葡萄球菌形成的生物膜结构达到稳定。此团队还证明，DNABII家族(整合宿主因子和组蛋白样蛋白)是NTHi形成生物膜EPS的关键组成部分，对于NTHi生物膜的结构完整性、稳定性至关重要[25]。研究还表明生物膜的eDNA可能通过电荷相互作用结合人β-防御素(human beta defensin-3，hBD-3)，从而抑制hBD-3杀死NTHi的能力，而随着生物膜的成熟，eDNA丰度的增加可以最大限度地限制中耳内新产生的抗菌肽(antimicrobial peptide，AMP)有效根除NTHi生物膜的能力[26-27]，从而增加生物膜的厚度。

1.2PV 包括NTHi在内的多种黏膜相关病原体已经进化出快速适应宿主的机制，称为PV。它促进了整个细菌基因组中众多基因的协调调控，这种表观遗传调控可以是通过DNA甲基转移酶(由ModA基因调控)的PV发生的。PV能调节NTHi对氧化应激的敏感性、对中性粒细胞介导杀伤的抵抗力，这对于NTHi适应、逃避宿主的免疫系统具有重要意义。除此之外，PV还能通过调节NTHi生物膜的生物量及其周围eDNA及DNABII的量来影响生物膜的形成。PV对eDNA和DNABII具有调节作用，在碱性条件下，表达ModA2甲基转移酶的NTHi生物膜比ModA2缺陷菌株形成的生物膜具有更大的生物量、更少的eDNA及独特结构。因此，PV除了能逃避免疫系统外还能调节生物膜的形成。关于NTHi的多个研究证明，稳定的生物膜结构有助于其定植，同时也是慢性感染不可或缺的因素[14, 28-29]。

1.3LOS及唾液酸 研究证明NTHi诱导的未成熟和成熟的生物膜都含有唾液酸化的LOS，适应宿主的NTHi利用宿主的唾液酸作为碳源，利用外膜糖脂LOS的末端糖作为其营养物质，并将这种糖结合到LOS中。LOS末端是血清中天然存在的免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)结合的靶标，它可以利用宿主衍生的唾液酸 (Neu5Ac) 进行唾液酸化，通过LOS唾液酸化可以减轻IgM的杀伤[30]。最新研究表明，NTHi已进化为优先利用N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac)(非人类唾液酸)形式的唾液酸，这种适应使 NTHi能够逃避针对N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc)的人类血清抗体反应的杀伤作用[31]。因此他们在生物膜形成和免疫逃避中都具有重要作用。

1.4外膜蛋白 Gallaher等[32]发现由NTHi形成的生物膜EPS含有大量的细菌蛋白，包括1种高分子量蛋白(high molecular weight protein，HMW)1和3种主要的外膜蛋白(P2、P5 和 P6)。除此之外，有研究发现，Hi黏附素(Hi adhesin, Hia)除了直接介导与宿主细胞的黏附外，还可能直接与LOS上的唾液酸结合以介导细菌的相互作用并增强NTHi生物膜的形成和稳定性，是生物膜形成的决定因素，因此生物膜可能通过Hia增强对抗生素的耐药性，干预Hia可以在NTHi引起的侵袭性疾病中对预防生物膜的形成发挥关键作用[33]。

1.5菌毛蛋白 NTHi的Tfp在细菌、细胞运动中起着重要作用，使它们能够附着并沿着生物组织或环境表面移动(抽搐运动)，形成菌落和生物膜[34]。Tfp由Ⅳa型菌毛蛋白和Ⅳb型菌毛蛋白组成。Ⅳb型菌毛蛋白参与生物膜形成、细菌定植和对细胞的黏附[35]；Ⅳa型菌毛蛋白是细菌抽搐运动和其他功能(如DNA 摄取)实现的分子框架[36]，它的灵活性、伸长率和收缩性确保了这些不同的功能的实现[37]。

1.6自身诱导物-2(autoinducer 2，AI-2) NTHi生物膜中的分形界面可以在空间位置捕获由NTHi分泌的AI-2等分子，NTHi产生的AI-2的定位可能会为群体感应产生空间反馈，它能参与生物膜基质合成的糖基转移酶的表达，从而促进了NTHi生物膜的成熟和生物膜完整性的维持[23, 38]。

1.7OMV 研究发现浮游细胞和生物膜均可释放OMV，它是生物膜EPS的重要组成部分[39]。OMV是纳米大小的球形双层蛋白脂质，它由包括NTHi在内的各种革兰阴性菌释放，含有蛋白质、脂质、核酸和代谢物[40-41]。研究证明，OMV参与革兰阴性杆菌的营养吸收，能增强其耐药性、促进其与宿主的黏附及向宿主传递毒力因子[42]。OMV相互间还能传递遗传信息，增加了B细胞对其他可溶性成分(如B细胞激活因子)的敏感性[39]。存在B细胞激活因子的情况下，NTHi的OMV强烈激活B细胞并诱导多克隆T细胞非依赖性免疫反应，这可能会使宿主免疫反应延迟。有研究结果表明，OMV可能与距离定植位点较远的免疫系统相互作用，这对宿主体内的细菌存活非常有益[43]。最后，革兰阴性菌的OMV和内毒素诱导玻连蛋白释放到支气管肺泡间，有利于逃避补体介导的免疫清除[44]。

2 NTHi生物膜的致病机制

组成NTHi生物膜的成分多种多样，其详细的致病机制尚未研究清楚。目前对其致病机制的研究主要集中在抗生素耐药和免疫逃避两方面。

2.1抗生素耐药 研究表明，与浮游生物相比，包括NTHi生物膜在内的细菌聚集可以保护细菌免受抗生素的清除，而且细菌侵入人体组织细胞内会导致抗生素治疗失败，这是因为在生物膜中抗菌剂渗透率有限以及细菌代谢率降低会增加细菌对抗生素的抗性，导致大多数常规抗生素无法以正常浓度作用于细菌[15, 45]。

2.2免疫逃避机制 NTHi的独立致病因素，如人补体抑制因子H[46]、外膜蛋白P4[47-48]、HMW和Hia蛋白[49]、分泌型免疫球蛋白A1蛋白酶(IgA1 protease, IgA1P)[50]、LOS[51]、唾液酸[30-31, 52]、磷脂酰胆碱[53]等，可以减弱补体、抗体和中性粒细胞的杀伤作用，抑制炎症反应达到免疫逃避，详见表1。NTHi生物膜除继承了NTHi的独立致病因素和免疫逃避功能外，还可以通过限制AMP对细菌的清除[26-27]、诱导多克隆T细胞非依赖性免疫反应、延迟宿主免疫反应与距离定植位点较远的免疫系统相互作用，提高细菌存活能力[43]。

3 NTHi导致的耐药、免疫逃避的应对方案

Hib疫苗显著减少了Hib的鼻咽部定植，由于以荚膜多糖为靶抗原制成的Hib疫苗对NTHi菌株几乎没有交叉预防作用，NTHi感染的发病率逐渐升高，成为目前Hi感染的主要亚型，给易感人群(尤其是经济落后地区的易感人群)带来了巨大的危害[54-55]。

研究表明，(基因)工程化的 OMV可以在Hi表面展示完整的异源蛋白质，并有效地触发特异性抗体反应，可用作疫苗的一种新的可行的抗原呈递工具，以诱导保护性免疫，明确是否可以通过OMV研制相关疫苗预防NTHi感染的研究正在进行中[56]。Bailey等[57]开发了一种与传统疫苗不同的旨在介导生物膜破坏的疫苗，这种疫苗在起效过程中不会造成肠道微生物群失调。NTHi表达的LOS可以通过黏附和逃避补体介导的杀伤来增强其毒力，进一步加强对LOS的研究有利于新疫苗靶抗原和新抗生素靶点的鉴定，从而加强对Hi侵袭性疾病的预防和治疗[58]。

由于目前疫苗覆盖的Hi血清型有限，研发周期长、经费高昂且不能根据致病优势菌及时调整上市，再加上各国经济水平参差不齐，大部分发展中国家和落后国家负担不起疫苗的接种，低廉易得的抗生素使用仍是治疗Hi所致感染的最重要手段。舒巴坦、他唑巴坦、克拉维酸钾是β内酰胺酶抑制剂，与β内酰胺类抗生素类药物联用能协同提高彼此的抗菌活性并扩大抗菌谱。何萍等[59]研究表明，苏州地区儿童革兰阴性菌的耐药率与β-内酰胺酶的检出率呈正相关，据此他们提出临床上多应用β内酰胺类抗生素及β内酰胺酶抑制剂合剂来减缓Hi的抗生素耐药性。Mokrzan等[60]设想使用特异性诱导抗体联合传统抗生素来治疗这些生物膜导致高度耐药的Hi菌株，首先通过释放NTHi抗体杀死细菌，如果免疫效果欠佳，则可同时辅以传统抗生素将其杀死，这样抗生素使用剂量减少、使用时间缩短，从而减少对人体组织、脏器的损害和口服抗生素的其他不良后果，如抗生素耐药性的增强和肠道菌群的破坏。

为减少抗生素耐药性的产生，除联合使用抗生素、优化抗生素治疗方案外，人们正在寻求抗生素替代品。AMP可通过直接致死和免疫调节两种主要方式来对抗细菌感染，有望用于治疗多重耐药菌株。但是，由于成本高、易被酶降解及对真核细胞具有细胞毒性等局限性使其在临床应用受限[61]。噬菌体可以通过分泌细胞壁水解酶、胞外多糖解聚酶等破坏细菌生物膜结构达到治疗细菌生物膜所致疾病的目的，具有研发周期短、成本低、副作用少、特异性强等特点，但其应用仍主要停留在动物试验阶段，未在人体临床试验取得质的突破，应用于临床的依据不足[62]。

根据NTHi生物膜的致病机制研究者们提出了不少新方法应对其导致的免疫逃避和抗生素耐药。近年来，除Hib外其他血清分型疫苗的研究进展缓慢，加上疫苗从靶标的提出验证再到研制、试验周期过于漫长，研发费用高昂，未来研究的重点仍以降低抗生素耐药率为主。虽然AMP、噬菌体替代抗生素治疗细菌感染的观点被提出并有人在动物试验中对其进行了验证，但由于其局限性和人体试验数据的缺乏使得它们难以推广，因此仍需要设计相关动物、人体试验对其进行求证[61-62]。同时也要继续加强对NTHi的生物膜形成和致病机制的研究，并提出更多切实可行的临床防治方法来预防和治疗NTHi侵袭性疾病，最后当我们在西医上遭遇瓶颈时，思维可以往中医、中成药方面延伸。