微波预处理对油茶籽毛油抗氧化性的影响

王龙祥， 罗 凡， 许晓君， 杜孟浩， 方学智， 钟海雁

(中南林业科技大学食品科学与工程学院1，长沙 410004) (中国林业科学研究院亚热带林业研究所2，杭州 311400)

关键字：油茶籽油；微波；总酚；美拉德产物；DPPH

油茶(CamelliaoleiferaAbel)，山茶科(Theaceae)山茶属(CamelliaL.)常绿小乔木或灌木，是我国特有的经济效益和生态效益俱佳的木本油料物种,广泛种植于我国南方各省[1]，尤其是在湖南省,油茶籽油占湖南省植物用油的50%以上[2]。截止到2020年，我国油茶籽种植面积达6 800万亩，茶油产量约为62.7万t，油茶产业总产值达1 160亿元。

油茶籽油是从油茶籽仁中提取出来的植物油，其营养丰富，含有多酚、角鲨烯[3]、甾醇[4]等多种天然抗氧物质，且有些油茶籽油经过高温预处理时会产生美拉德产物等抗氧化物质。茶油的抗氧化性一直是油茶研究的一个热点。目前油茶籽油具有较好稳定性的主要机理还未达成共识，油茶籽油的氧化稳定性可能是多酚、美拉德产物等物质的共同作用的结果[5]。

多酚是国内外研究油茶籽油抗氧化性能时分析最多的一种抗氧化物，油茶籽油的保健功能与其有密切关系[6]。刘雳等[7]证实了油茶籽毛油中极性酚类物质的存在，且确定该物质与油茶籽油储藏稳定性有关。李志晓[8]发现多酚含量与1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)阳离子自由基清除能力和铁离子还原能力(FRAP)极显著相关。刘静等[9]发现油茶籽油的抗氧化活性和防紫外辐射活性与多酚含量相关。这也与“极性悖论”假说有相通之处，“极性悖论”认为极性强的抗氧化剂往往在油脂体系中能表现出更强的抗氧化活性，因为油脂体系中极性强的抗氧化剂容易被排斥到油气界面从而保护油脂[10]。

美拉德反应，即羰氨反应，是由Hodge[11]提出的较为复杂的氨基化合物和糖基化合物之间的反应。其反应较为复杂，故产物也较多且有些产物具有一定的抗氧化性，如羟甲基糠醛[12]、α-羰基化合物[13]等等。5-羟甲基糠醛(5-HMF)是羟甲基糠醛的代表物质之一，是美拉德反应的重要中间产物，是褐变的指标成分之一，且具有一定的抗氧化作用[14]。丙酮醛(MGO)、3-脱氧葡萄糖醛酮(3-DG)是美拉德反应中级阶段产生的α-二羰基化合物，具有较高的活性。丙酮醛是一种小分子的高活性二羰基复合物，在美拉德反应中其产生于中级阶段Amadori重排后分解所产生，具有抗肿瘤[15]等活性作用。3-脱氧葡萄糖醛酮(3-DG)是美拉德反应中产出的一种高反应性中间产物[16]。这几种α-羰基化合物都是美拉德风味和色泽的重要前体，具有活性高、稳定性低的特点[17]。

在油茶籽预处理中，微波预处理是一种较为新的预处理方式，其是利用高频电磁场快速改变产生能源，物质吸收微波能量后通过分子的震动摩擦将能量转化为热能。这种加热的方式具有高效节能、清洁无污染的特点[18]。微波预处理后是否引起油茶籽油的抗氧化能力显著变化，其内部抗氧化物质的含量及抗氧能力是否发生显著改变，这对研究油茶籽油的氧化稳定性具有重要意义。

本实验以油茶籽仁为原料，经微波预处理测定油茶籽毛油DPPH、总酚含量及抗氧化能力和美拉德产物的含量，分析微波预处理对油茶籽毛油中抗氧物质的影响，为油茶籽毛油氧化稳定性规律提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料处理与提取

油茶籽清理除去未成熟、破损和霉变粒后，经测定[19]其含水率为(8.81±0.04)%，油茶籽仁含油率为(37.14±1.09)%。

油茶籽仁处理：油茶籽一定条件微波预处理后剥壳得到油茶籽仁，通过液压榨取油茶籽毛油，冷藏备用。样品处理条件如表1所示。各功率加热最大时间时温度依次为120、140、190、220 ℃。

表1 样品处理条件

DPPH测定茶油全油样品制备：参照文献[20]方法，略做改动：称取0.5 g油茶籽毛油，乙酸乙酯定容。

总酚样液提取：采用固相萃取提取油茶籽毛油中的总酚[21]。

美拉德产物提取[22]：称取5 g油茶籽毛油，用甲醇萃取3次后定容至10 mL，冷藏备用。

1.2 试剂与仪器

二醇基固相萃取柱(500 mg·3 mL-1)，福林酚、2,2-联苯基-1-苦基肼基(96%，DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(99%，TPTZ)、2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(98%，ABTS)、丙酮醛(MGO)、3-脱氧葡萄糖醛酮(3-DG)、5-羟甲基糠醛(5-HMF)、水溶性维生素E(97%，Trolox)、过硫酸铵、无水碳酸钠、没食子酸、乙酸乙酯、无水乙酸钠、冰乙酸、浓盐酸、氯化铁、邻苯二胺、氢氧化钠、无水乙醇，均为分析纯；正己烷、甲醇为色谱纯。

S-114分析天平，Agilent LC1260Ⅱ液相色谱仪，P70F20L-DG(S0)微波炉，6YY-190自动液压榨油机，Q-101平行蒸发仪，Avanti J-E冷冻离心机，UV-2550紫外可见光分光光度计。

1.3 方法

油茶籽毛油DPPH测定：参考文献[23]并略做改动，定容后取1 mL，与3 mL DPPH乙酸乙酯溶液混合避光反应2 h，517 nm测定吸光值，以Trolox为标准物，绘制标准曲线，DPPH测定能力以μg TE/g表示[24]。

总酚测定：参考文献[25]，并略作调整，取1 mL样品于10 mL具塞试管内，加入5 mL 10%福林酚试剂，反应8 min 后再分别加入4 mL 7.5% Na2CO3，振荡10 s后室温下静置1 h，765 nm 处测定吸光度，以没食子酸为标准物，测定标准曲线，样品浓度以没食子酸浓度计算，以μg GAE/g表示。

总酚ABTS测定：参考文献[26]，略作调整，移取样品0.5 mL总酚样液于10 mL刻度试管中，加入ABTS工作液3.5 mL，设置空白，空白中1 mL水代替样液，30 ℃水浴6 min，在734 nm波长处测定吸光值，以Trolox为标准物，绘制标准曲线，DPPH测定能力以μg TE/g表示。

总酚FRAP测定：参照文献[27]，并略作调整，移取0.2 mL总酚样液和3.8 mL FRAP溶液混合后，37 ℃水浴黑暗状态下放置30 min，在593 nm处测定其吸光度值，以Trolox为标准物，绘制标准曲线，DPPH测定能力以μg TE/g表示。

美拉德产物(5-羟甲基糠醛、丙酮醛、3-脱氧葡萄糖醛酮)测定：结合文献[28，29]并参照课题组之前方法[30]，进行测定。

5-羟甲基糠醛的高效液相色谱检测条件：流动相A：0.1%冰醋酸溶液，流动相B：甲醇，流速0.7 mL/min，柱温：40 ℃，进样量：10 μL，检测波长280 nm，色谱柱型号：ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)，检测器：SPD紫外检测器，时间程序如表2所示。

表2 5-羟甲基糠醛的液相色谱洗脱程序

3-脱氧葡萄糖醛酮、丙酮醛的高效液相色谱检测条件：流动相A：0.1%冰醋酸溶液，流动相B：甲醇，流速：0.8 mL/min，柱温：40 ℃，进样量：10 μL。检测波长314 nm，色谱柱型号：ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)，检测器：SPD紫外检测器，时间程序如表3所示。

表3 二羰基化合物的液相色谱洗脱程序

1.4 数据处理方法

所有数据采用Microsoft Excel 2007、SPSS 22、Origin 9进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 油茶籽毛油的DPPH含量分析

自由基氧化是常见的食用油氧化原因之一，DPPH自由基清除能力来评价抗氧活性已作为常用标准[31]。微波预处理油茶籽毛油DPPH含量变化如图 1所示。油茶籽毛油中DPPH清除自由基能力受微波处理影响显著。微波功率在420 W时DPPH随时间变化不显著(P>0.05)，但在245、560、700 W时，其含量随着时间变化显著增加(P<0.05)。DPPH含量最高为700 W 20 min处，为(337.08±6.07) μg TE/g，是初始含量(232.40±4.74) μg TE/g的1.45倍，最低为700 W、5 min处，为(204.55±9.63) μg TE/g，是初始含量的0.88倍。推测初始微波加热时间较短，油茶籽油抗氧物质以消耗为主，随着时间和微波功率的增加，抗氧物质逐渐从细胞中溶出，使得DPPH增加。此外，也可能有非抗氧物质的转化使DPPH逐渐升高。

图1 油茶籽毛油中DPPH的含量变化

2.2 总酚含量及抗氧能力分析

2.2.1 总酚含量

微波预处理油茶籽毛油中总酚含量的变化情况如图2所示。油茶籽毛油中总酚含量受微波功率影响显著(P<0.05)。 推测短时微波加热能够直接破坏细胞壁结构，使得油中酚类物质更加容易溶出[32]，且随着时间的延长除了酚类的溶出还有可能一些其他非酚类物质转化为酚类物质，使得总酚含量增加较快。由图2可看出，最高值为700 W 20 min处，为(193.04±9.38)μg GAE/g，为初始(5.13±1.04)μg GAE/g的37.63倍；最低值为245 W 5 min处，(4.43±0.36)μg GAE/g，为初始的0.86倍，推测可能由于初始功率较低，总酚含量因多酚氧化消耗导致含量降低，但随着酚类物质溶出会使得总酚含量逐渐升高。245、420、560、700 W的功率下20 min处为最大值，含量分别为245 (12.25±0.86)、(37.66±0.85)、(137.89±6.22)、(193.04±9.38)μg GAE/g，最高与最低相差15.76倍。此外发现700 W 10 min处总酚的含量有降低再增加的过程，推测是由于功率较高，使得初期总酚的消耗较大，但随着时间增加多酚物质溶出和非酚类物质转化又使得总酚含量增加。这与罗凡等[33]研究结果相一致。

图2 油茶籽毛油中总酚含量变化

2.2.2 总酚中ABTS分析

微波预处理油茶籽毛油总酚中ABTS含量变化如图3所示。油茶籽毛油中总酚ABTS受微波功率影响显著(P<0.05)。推测微波功率增加使得总酚溶出率增加导致ABTS增加[34]。ABTS含量最高值为700 W 20 min处，为(192.57±3.71)μg TE/g，是初始值(8.44±0.28)μg TE/g的22.82倍，最低为初始值。每个功率下20 min处为最大值，245、420、560、700 W条件下的含量分别为(26.95±1.18)、(75.24±8.97)、(187.15±4.41)、(192.57±3.71)μg TE/g，最高与最低相差7.14倍。此外发现700 W 10 min处含量有先降低再升高的现象，这与总酚含量变化类似，经测定ABTS含量与总酚含量具有显著相关性(P<0.05),线性相关系数为0.98，这与李志晓[8]研究结果相一致，因此总酚含量降低使得ABTS降低。

图3 油茶籽毛油总酚中ABTS含量变化

2.2.3 总酚的FRAP分析

微波预处理油茶籽毛油总酚FRAP含量变化如图4所示。油茶籽毛油中总酚FRAP受微波功率影响显著(P<0.05)。推测微波预处理属于内部加热方式，处理使得细胞壁结构直接破坏导致溶出率升高，进而总酚含量升高，使得FRAP含量增加[35]。FRAP含量最高值为700 W 20 min处，为(295.32±14.11)μg TE/g，是初始含量(4.33±1.62)μg TE/g的68.2倍，最低值为初始值。每个功率下20 min处为最大值，245、420、560、700 W下含量分别为(23.57±0.32)、(72.92±1.47)、(225.98±16.93)、(295.32±14.11)μg TE/g，最高与最低相差12.53倍。且对比发现，总酚对FRAP的清除能力与ABTS清除能力存在差异，这也说明多酚对不同抗氧化机制的影响程度也不同。

图4 油茶籽毛油中FRAP的含量变化

2.3 美拉德产物含量分析

2.3.1 5-HMF含量分析

微波预处理油茶籽毛油5-HMF含量变化如图5所示。油茶籽毛油中5-HMF受微波功率影响显著(P<0.05)。这与江姗姗等[36]研究相一致。5-HMF含量最高为560 W 20 min 处，为(26.76±1.46)μg/g，是初始含量(4.21±0.03)μg/g的6.36倍，最低值为420 W 10 min 处，为(3.99±0.01)μg/g，为初始含量的0.95倍。每个功率下20 min处为最大值，245、420、560、700 W条件下的含量分别为(4.60±0.02)、(10.49±0.10)、(26.76±1.46)、(21.34±0.32)μg/g，最高与最低相差5.82倍。推测微波预处理初期，油茶籽细胞壁较难破壁，5-HMF较难溶出，随着微波功率增加和时间延长，5-HMF逐渐溶出和一些其他物质转化生成使得其含量增加。但在微波功率为700 W 20 min时发现，其含量小于560 W，推测高功率下，5-HMF随时间延长进一步反应生成糖醛或者类黑素使其含量降低[37]。因此，5-HMF的最适条件为560 W 20 min。

图5 油茶籽毛油中5-HMF的含量变化

2.3.2 MGO含量分析

微波预处理油茶籽毛油MGO含量变化如图6所示。油茶籽毛油中MGO受微波功率影响显著(P<0.05)。MGO含量最高为700 W 20 min处，为(13.60±2.18)μg/g，是初始含量(1.22±0.01)μg/g的11.15倍，最低为245 W 5-15 min、420 W 10 min处，低于检测限；每个功率下在20 min处具有最大值，245、420、560、700 W条件下的含量分别为(1.60±0.08)、(4.04±1.16)、(6.72±0.27)、(13.60±2.18)μg/g，最高与最低相差8.5倍。推测MGO作为美拉德反应中级阶段strecker裂解的二羰基产物之一[38]，初期微波频率较低时间较短，MGO参与美拉德下一步反应生成醛醇类或脱氮聚合物等使得含量降低[39]，随着功率增加和时间的延长，MGO含量伴随美拉德反应逐渐增加[40]。因此，MGO的最适功率为700 W 20 min。

2.3.3 3-DG含量分析

图6 油茶籽毛油中MGO的含量变化

微波预处理油茶籽毛油3-DG含量变化如图7所示。油茶籽毛油中3-DG受微波功率影响显著(P<0.05)。3-DG含量最高值在700 W 20 min处，为(75.46±3.79)μg/g，是初始值(2.52±0.12)μg/g的29.94倍，最低为245 W 15 min处，为(2.00±0.26)μg/g，是初始值的0.79倍。每个功率下20 min处为最大值，245、420、560、700 W条件下的含量分别为(4.34±0.14)、(24.44±6.49)、(73.16±3.69)、(75.46±3.79)μg/g，最高与最低相差17.39倍。推测3-DG作为美拉德反应中高反应性中间产物，由于初期微波功率较低和时间较短，3-DG参与美拉德下一步反应生成酮亚胺类使得含量降低，随着功率增加和时间延长，3-DG随着美拉德反应含量逐渐增加[41]。因此，3-DG的最适功率为700 W 20 min。

图7 油茶籽毛油中3-DG的含量变化

3 结论

以油茶籽仁为原料，研究微波预处理对油茶籽毛油抗氧物质的影响。结果表明微波预处理对油茶籽油抗氧能力具有显著性影响。油茶籽油DPPH自由基清除能力在700 W 20 min处有最大值，为(337.08±6.07)μg TE/g。微波预处理对总酚含量及其抗氧化性具有显著影响，多酚对ABTS阳离子自由基清除能力小于铁离子还原能力。在700 W 20 min时多酚含量及抗氧能力最高，为(193.04±9.38)μg GAE/g，总酚ABTS为(192.57±3.71)μg TE/g，FRAP为(295.32±14.11)μg TE/g。微波预处理对美拉德产物含量具有显著影响，美拉德产物随着微波功率增加而增加。5-HMF在560 W 20 min处有最大值(26.76±1.46)μg/g，二羰基产物在700 W 20 min有最大值MGO 为(13.60±2.18)μg/g，3-DG为(75.46±3.79)μg/g。

油脂抗氧化机制是一个比较复杂的过程，油茶籽油的氧化稳定性可能是多酚、美拉德产物、甾醇和角鲨烯等抗氧物质共同作用的成果，但如何相互作用需进一步研究。