基于特征标志物的粮油食品掺假鉴别技术研究进展

赵璐瑶， 段晓亮， 张 东， 刘建垒， 常 柳， 商 博， 孙 辉

(国家粮食和物资储备局科学研究院，北京 100037)

粮油食品是我们日常生活中很重要的一部分，对其正确的掺假鉴别对食品的安全性和真实性都具有重要意义。利益驱动的粮油食品掺假行为不仅危及食品市场的公平秩序，还侵犯了消费者的合法权益。目前，常见的食品掺假行为包括冒充、稀释、违法添加非标注成分等，其中，冒充和稀释大多为质量和营养问题，如低值菜籽油冒充高值橄榄油、普通大米冒充有机大米等，而掺杂不符合卫生和安全标准的低值食品则存在安全问题。同时，违法添加非标注成分也存在安全问题，如在食用油中添加地沟油等。另外，五常稻花香大米作为地理标志食品，其掺假普通大米的现象还涉及原产地问题。有机大米、橄榄油及全麦粉等是粮油食品掺假最为常见的食品，开展食品掺假鉴别技术研究已经引起全球食品质量安全领域的广泛关注[1, 2]。

粮油食品掺假鉴别分析主要依赖于粮油食品中的特异标志物(详见表1)。与粮油食品地域相关的标志物，包括与土壤和环境相关的矿物元素指标，以及与水源相关的H和O同位素指标等[3]；与品种等有关但受多种因素影响的标志物，包括粮油食品的总化学成分、遗传物质、感官特性等[4, 5]。粮油食品基质具有复杂性，随着食品产业的迅速发展，掺假方式也逐渐隐蔽化，亟须具有可预测性和非目标性的检测技术对粮油食品的真实属性进行有效鉴定。

表1 粮油食品掺假鉴别特异性标志物

目前，分子生物学分析、元素分析、同位素分析、色谱-质谱分析等技术均已被用于粮油食品掺假鉴别的标志物的研究中。元素差异分析技术[6]主要应用于地理标志性食品鉴别和微生物表征[7]，一般适用于不同产地来源的未加工粮油食品原料的鉴别，具有较高的准确性。基于DNA指纹图谱的鉴别技术对于不同品种的粮油食品原料的鉴别具有准确度高的优点，但由于DNA在加工如焙烤、煎炸等过程中极易被破坏，因此不太适用于粮油加工食品掺假鉴别分析。代谢组学分析[8]则基于粮油食品体系内所有小分子代谢产物同时进行定性和定量分析，感官差异[9]的本质也源自粮油食品体系内的各类小分子代谢物的差异，可同时应用于粮油食品原料和加工粮油制品的分析，尤其是复杂粮油食品体系的真实性鉴别研究，在掺假行为日渐隐蔽的现状下，具有很好的应用前景。本文综述了近年来基于粮油食品中特征标志物的掺假鉴别技术的研究进展，并展望了未来该领域的研究趋势。

1 元素分析技术

目前，基于元素的掺假鉴别分析技术主要依赖于同位素质谱(IR-MS)和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)两大类仪器，通过对不同来源粮油食品中的元素特征进行分析，再结合建模软件，从而确定可以实现掺假鉴别分析的特征标志物。常见的掺假鉴别标志物有稳定同位素如δ2H、δ13C、δ15N等，以及无机元素Cu、Fe、Co、Ni、Sr、Se、Rh、Eu、Pr等。

1.1 稳定同位素质谱技术 (IR-MS)

IR-MS技术[10]主要通过对粮油食品中不同元素同位素丰度的差异来将不同来源的粮油食品进行鉴别。通常，粮油食品原料中同位素组成受气候、地形、土壤及生物代谢类型等因素的影响会发生自然分馏效应，从而使不同来源粮油食品原料中的同位素自然丰度存在差异。因此，对于具有地理标志的粮油食品，通过原料内同位素丰度的差异可以反映食品地源性特征，稳定同位素作为标志物能为粮油食品地理标志提供更为有用的信息。目前，IR-MS技术在食品掺假鉴别领域应用广泛，如蜂蜜、动物性食品、果汁等[11-13]食品的鉴别，在粮油食品领域中主要应用于大米和食用油的掺假鉴别。

大米是人类膳食最重要的谷物之一，是全球一半以上人口的主食。从真实性的角度评估大米的地理来源对于保护消费者免受信息误导和欺诈非常重要。利用矿物元素分析技术对原产地进行分析时，需要对多个元素进行综合分析，才能得出比较可靠的结论。大米中稳定性同位素(如δ13C、δ15N、δ18O、δ2H、δ87Sr等)受气候、环境、生物代谢类型等因素影响会产生自然分馏效应，使不同来源的食品中同位素的自然丰度呈现差异，是鉴别大米原产地的良好标志物。Chung等[14]研究了利用碳、氮、氧、硫稳定同位素比值分析和化学计量学方法，对亚洲不同国家种植的同一水稻品种的地理起源进行了鉴别。结果显示，糙米的δ15N AIR值、δ18O VSMOW值和δ34S VCDT值受地理来源的影响明显大于δ13C VPDB值，尤其是δ18O VSMOW和δ34S VCDT的组合比其他组合更能有效地鉴别大米的来源。Chung等[15]研究探讨了δ13C和δ15N作为鉴别韩国有机大米的潜在工具的可行性。结果显示，δ13C和δ15N可作为鉴别韩国有机大米的特征标志物。

总之，在同位素质谱分析中，粮油食品原料中的氢同位素比值与生产区降水和地下水的氢同位素比值显著相关。碳氮同位素比值受种植方式和气候的影响。硫同位素比值受产地地理位置和地表地质条件的影响。基于同位素比值标志物的掺假鉴别分析，可以准确地反映粮油食品的来源。由于同位素比值标志物的测定依赖大型仪器同位素质谱，且其知名度和仪器市场占有率没有质谱联用技术高，因此限制了该掺假鉴别技术的发展。

1.2 等离子发射光谱-质谱法(ICP-MS)

作为质谱联用技术的一种，ICP-MS[16]能够在痕量和超痕量水平上，对粮油食品中的金属或非金属元素进行定量检测和分析。由于各粮油食品原料产地的环境，如地质、气候和栽培方式等的不同，结合化学计量学方法能够获得粮油食品独特的元素标志物，从而达到对粮油食品掺假鉴别的目的。该技术与IR-MS类似，都是通过反映食品原料的地理特征[3]，来达到掺假鉴别的目的。但是在对地理来源特别接近的粮油食品进行掺假鉴别时，则难以达到预期效果。

ICP-MS具有检测限低，分析速度快和多元素同时分析等优点，被越来越多的研究者应用到粮油食品掺假鉴别分析中。Endler等[17]采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对巴西50份大米(包括18份有机大米和32份普通大米)进行了20种元素含量的分析，结果有机大米的砷、硼、钡、钴、铬、铜、锰、磷、锌含量较高，而普通大米中的钾、钙、钼、铷、硒含量较低。主成分分析(PCA)、类类比软独立建模(SIMCA)、层次聚类分析(HCA)和K-近邻(KNN)统计结果显示这些元素指纹图谱均能很好地区分有机和普通大米，可作为区分有机和普通大米的特征标志物，成为常规鉴别有机大米的替代方法。

大米是中国传统主食，其营养、加工品质不仅与品种有关，还受当地气候、土壤等特殊条件的影响。目前，我国有许多地理标志产品，如中国的稻花香大米、盘锦大米、延边大米、珍宝岛大米等。这些大米具有独特的地理特征和品质，在进出口贸易中可享受减免关税等方面的优惠。相信随着大米掺假鉴别技术的不断发展和提升，未来能够开发出更加有效鉴别有机大米和地理标志大米真实性的技术，切实保障市场公平竞争，保护消费者和合法企业的利益，促进食品产业的健康发展。

2 色谱-质谱联用技术

色谱-质谱联用法通常包括液相色谱-质谱联用技术和气相色谱-质谱联用技术，可充分发挥色谱的高效分离性能和质谱的高灵敏度优势，通过色谱的时间分离和质谱的空间分离的有机结合从而实现对粮油食品中特征标志物的分析和检测，进而实现对不同粮油食品的掺假鉴别分析。基于色谱-质谱联用法的适用性，常见的特征标志物包括黄酮类、多酚类、氨基酸、挥发物、脂质等小分子等[18, 19]，通过分别对真伪粮油食品中不同物质的含量进行测定，进而发现可以实现掺假鉴别分析的特征标志物是常见的研究思路。

2.1 高效液相色谱-质谱(HPLC-MS/MS)

HPLC-MS/MS[20]是以高效液相色谱为分离手段，以质谱为检测工具的一种分离分析技术。因其适用范围广、灵敏度高、定性定量能力强等诸多优点[21]，在粮油食品掺假鉴别分析领域中被广泛使用，尤其适用于粮油食品中特征小分子化合物的分析和检测，如多酚类和黄酮类物质等。但是由于目前粮油食品中一些特征化合物的商用标品不够全面，导致在对一些特征标志物的定性和定量方面缺乏依据。

除此以外，新型小品种油也正进入大众视野，由于其价格昂贵，因此亟需相应的掺假鉴别技术的研究和应用。Shi等[22]通过测定脂肪酸、角鲨烯和植物甾醇等物质的含量，结合化学计量学方法，对掺杂有棕榈油、精制橄榄油、高油酸向日葵油、葵花油、玉米油、米糠油、米油、花生油、芝麻油、豆油以及菜籽油的山茶油进行了分析检测。结果显示，山茶油具有较高的三萜醇的特征，PCA显示其与其他植物油有明显区别。采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，将不同质量分数(5%～100%)的棕榈油等掺入山茶油中进行分类，当掺伪率大于30%时，可将其准确分类，且准确率为92.31%。因此，基于脂肪酸、角鲨烯和甾醇等多类组分混合的特征标志物进行植物油的掺假鉴别具有准确度高的优点，不失为一种很好的鉴别山茶油的研究方法。

随着加工技术的不断进步和消费者需求的日益增长，小麦粉的种类和价格也逐渐多样化，由此引起的掺假问题正引起科研人员的关注。全麦面粉相比普通面粉营养更为丰富全面，Ping等[23]建立了区分全麦粉与精制小麦粉制作的面包的方法，采用正离子-常压化学电离(APCI)技术，对面包样品的化学成分进行了UPLC-HRAM-MS分析。PCA和类类比软独立模型(SIMCA)揭示了全麦粉和精制小麦粉制作的面包样品的化学差异，结果表明醇酰间苯二酚是鉴别两种面粉的特征标志物，甘油三酯(DGs)和磷脂酰乙醇胺(PE)也对分类有显著的贡献。醇酰间苯二酚并不是小麦粉中常见的组分，可见质谱技术在找到特异标志物方面具有相当大的优势。

这些结果表明，代谢组学方法是一种可靠、准确、有效的实现粮油食品掺假鉴别方法。基于代谢组学的研究通过非靶向和靶向的方式可以找到不同粮油食品中的潜在的特征标志物，但是该技术需要大型分析仪器，造价高，且需要专业人员操作分析，不利于方法的推广。同时，由于配套的小分子化合物信息仍在完善中，实现更多高灵敏度的特征标志物的定性定量分析是该类方法发展的方向。

2.2 气相色谱-质谱法(GC-MS/MS)

近些年来，气相质谱联用技术不断发展，检测灵敏度不断提高，尤其是在顶空进样和二维气相等技术的不断发展和应用[24]，该技术逐渐在分析挥发性成分，从而进行粮油食品掺假鉴别研究方面的优势日益显著。GC-MS/MS适用于粮油食品中一些易挥发小分子特征标志物的检测和分析[25]，对于一般非极性标志物，在测定时需要衍生。因此该技术的适用范围不如HPLC-MS/MS广。

目前，已有很多关于大米中挥发物研究的报道，如煮熟大米中挥发物的分析鉴定，糙米和大米中挥发成分的差异分析，香米和普通大米的挥发成分差异分析等[26, 27]，也有研究集中在对大米的掺假鉴别分析等领域。Chevallier等[28]研究了一种顶空气相色谱-质谱(GC-MS)方法，用于表征大米中挥发性有机化合物(VOCs)的组成和含量，以区分中国、印度和越南的大米样品。结果显示，基于PLS-DA模型找到了一组鉴别中国、印度和越南的大米样品的挥发组分标志物，包括1-己醇、庚醛、戊酸、己酸、长叶烯等，且具有良好的判别效果(R2=0.981 82，Q2=0.972 2，准确度=1.0)。

橄榄油因含有多种不饱和脂肪酸，受到了消费者的追捧，由于价格较其他食用油偏高，由此引起的掺假事件频繁发生。目前，橄榄油的掺假技术研究引起了国内外的广泛关注。由于受生长环境的影响，不同地域来源的橄榄油中，蛋白质、淀粉、脂质等有机成分的含量和组成存在一定的差异，可作为橄榄油原产地和品种鉴别的标志物。此外，油中的特征挥发物、多酚物质、脂肪酸和甾醇等目前也作为特征标志物应用于各类食用油的掺假鉴别中。Mildner等[25]研究了3种快速挥发性成分分析方法来区分掺有榛子油的初榨橄榄油样品。分析方法包括SPME-GC-FID技术、MOS电子鼻(HS-Enose)技术、SPME-MS技术。结果显示，SPME-GC/MS和HS-Enose方法均可实现对橄榄油掺假鉴别分析，而SPME-MS技术对橄榄油鉴别的准确度最高，也最耗时。基于SPME-MS技术的特征标志物包括乙酸、乙酸乙酯、1-丁醇、3-戊酮、2-戊酮、戊醛等，表明基于挥发组分标志物的鉴别掺杂榛子油的橄榄油技术是可行的。

气质联用技术主要针对粮油食品中一些特征挥发物进行检测来实现对食品的掺假鉴别分析，由于只适用于小分子挥发物的分析，因此适用范围没有液质联用技术广泛。与液质联用技术类似，该研究需要依赖大型仪器，对人员的要求也高，不利于技术和方法的推广。同时，高灵敏度挥发性标志物的发现和鉴别也是其未来的方向。

2.3 液相色谱-飞行时间质谱(HPLC-qTOF/MS)

随着高分辨质谱的不断发展及各种小分子谱库的不断完善[29]，HPLC-qTOF/MS逐渐应用于粮油食品基质中小分子的分析和检测，尤其适用于未知成分及复杂成分的粮油食品的掺假鉴别分析，对于筛选粮油食品中的特征标志物，具有较好的发展前景。该技术尤其擅长分析粮油食品中的未知组分，通过非靶向的检测方式进行差异分析，因此通量更高。同时，高分辨质谱具有较高的灵敏度，有利于发现一些未知高灵敏的特征掺假鉴别标志物。

目前，国内外消费者对有机食品的需求正日益增长，因此，迫切需要开发更准确的有机粮油食品认证方法，以确保公平贸易和食品安全。有机大米价格高，一些不法商贩通常在有机大米中掺杂普通大米，或者用普通大米冒充有机大米，来获得高利润，严重危害了消费者的权益。Xiao等[30]建立了分析常规大米和有机大米样品的代谢物分析方法，采用UPLC-qTOF/MS，应用正交偏最小二乘判别分析法(OPLS-DA)对关键成分进行了鉴定，结果显示，锦葵花甙、松脂醇、兔胆碱、葡萄糖醛酸、香豆素和氢化辛可宁等8个次生代谢物可作为鉴别有机大米和常规大米的潜在生物标志物。

亚麻籽油和和芝麻油因其良好的营养价值而闻名。Brigante等[31]提出了一种基于非靶向代谢组学的分析亚麻籽和芝麻种子中多酚成分的分析方法，采用HPLC-qTOF/MS对2种不同种子中的多酚类物质进行了鉴定。基于化学计量学结果，最终选择了12种化合物包括奎宁酸、酒石酸、色氨酸、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸等特征标志物用来鉴别2种植物油。

基于HPLC-qTOF/MS的非靶向代谢组学技术尤其适用于复杂基质粮油食品的掺假鉴别分析，尤其对于粮油食品中未知添加物的鉴别分析具有显著优势。但是目前，HPLC-qTOF/MS技术还是受限于小分子数据库的完善度，相信随着数据库的不断发展和进步，该技术在粮油食品食品鉴别分析中的应用越来越多，未来也会有更多灵敏度高、特异性强的特征标志物被鉴定出来用于食品溯源分析中。

3 DNA指纹图谱技术

DNA指纹图谱技术是建立在DNA分子标记的基础上，以生物个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记。DNA 指纹技术可应用于动、植以及微生物源性食品的真伪鉴定、掺假鉴别以及名特优产品的掺假鉴别。粮油食品中的特征SSR ( Simple sequence repeat )和SNP ( Single nucleotide polymorphism)等均是实现掺假鉴别的有效标志物。基于DNA的掺假鉴别技术依赖于粮油食品原料的标记进行掺假分析，准确度更高，但是适用范围不广。比如一些食品在加工过程中，其DNA会被破坏，如烘焙、辐照等均可以对DNA造成伤害。

对于粮油食品来说，不同地域适合种植的品种不同，不同品种粮油食品中的遗传物质不同，利用此差异可对粮油食品进行掺假鉴别。因此，采用特异引物，建立各地区粮油食品中的特征性分子指纹图谱，可用于粮油食品的原产地和品种鉴别，且准确度较高。目前，DNA指纹图谱技术已应用于橄榄油的鉴别分析中。Uncu等[32]比较了DNA条形码分析和脂肪酸分析在鉴定橄榄油的植物来源上的优势。对籽油混合物建立了基于PCR的毛细管电泳(PCR-CE)方法。同时，采用气相色谱技术分析了脂肪酸组成。结果显示，基于trnL(UAA)内含子的多态性建立的PCR-CE方法在检测掺杂大豆油、棕榈油、油菜籽油、向日葵油、芝麻油、棉籽油和花生油的橄榄油掺假方面与气相色谱分析同样有效。此外，基于DNA的方法可正确鉴别出橄榄油中掺杂的榛子油，而通过脂肪酸谱分析不能得到很好的鉴别结果。Costa等[33]研究了DNA标记技术在优质橄榄油和其他油鉴别中的应用，认为利用遗传标记在食用油鉴别中具有较好的前景，也着重分析了DNA提取在整个过程中的关键作用。

近年来，分子标记技术也被广泛应用于谷物食品的掺假鉴别中。Pegels等[34]报道了用于小麦、大麦、黑麦和燕麦四种谷物真伪鉴别的实时荧光定量PCR方法。该研究针对小麦、大麦和燕麦的ITS1区DNA片段的多态性，以及黑麦MIPS基因的特异性，设计特异性引物/探针进行了检测。实时荧光定量PCR结果显示，该方法在小麦粉二元混合模型中的相对检出限为0.000 01%～0.01%。进一步应用于实际样品分析，检测270种食品和宠物食品中是否有小麦、大麦、黑麦和燕麦等原料，准确率为100%。可见，ITS1区DNA片段和MIPS基因可以作为鉴别四种麦的特征标志物，且准确度较高。

相比元素分析和质谱技术，基于DNA的掺假鉴别技术准确度更高。但是食用油因其成分复杂，且经历了精炼等过程，使得遗传物质大量损失。因此基于DNA的掺假鉴别技术更适用于粮油食品原料的鉴别。同时，有的食用油原料种子中存在转基因，由于碱基序列未知，使得基于DNA分析的食用油鉴别技术需要进一步改进和提升。同时，与DNA分析技术想配套的快检技术如能同步研发并成功运用，将利于现场粮油食品监测工作的推进。

4 多技术关联分析

部分粮油食品基质比较复杂，基于单一的技术确定的特征标志物难以对粮油食品实现准确的掺假鉴别，往往需要联合2种及以上技术进行粮油食品中成分和元素等特征标志物的分析，达到对粮油食品准确鉴别的目的。多技术的复合应用，尤其适用于对复杂粮油食品，或者地源很近的地标粮油食品鉴别分析，通过联合不同水平和种类的特征标志物，可以大大提高鉴别的准确度。

小麦是一种在世界范围内广泛种植的谷物，小麦粉是人类的主食之一。根据意大利的规定，在生产面食时，硬粒小麦(DW)中最高允许添加3%的普通小麦(CW)。因此，需要有效的方法来检测含CW的DW产品中CW的添加量，防止由于CW的过度添加。Casazza等[35]从形态学指标、近红外光谱、蛋白质含量指标和玻璃核/非玻璃核比值4个方面对鉴别DW和CW的方法进行了研究。采用PLS-DA建立了判别模型，准确率达99%。该研究从包括蛋白质含量的4个方面对普通小麦和硬粒小麦进行了鉴别，虽然准确度高，但方法包含指标较多，较难推广应用。如将蛋白质组学技术运用于该研究中，可能会找到特异的蛋白质标志物，并取得较好的判别结果。

随着粮油食品掺假鉴别领域新技术的不断涌现，结合已成熟的技术，不仅可以提高分析通量，还可以提高特征标志物的准确度和范围。Pattemore等[36]应用MALDI-TOF/MS技术，开发了一组SNP标志物，结果显示，只有一个品种不能与其他品种进行区分。不同于传统的DNA测序技术，MALDI-TOF/MS技术为鉴定SNP位点提供了一种新的思路。此外，Franz等[37]对62个普通小麦品种和14个软质小麦品种的γ-醇溶蛋白基因进行了部分测序，进而以γ-醇溶蛋白基因序列为基础，建立了基于DNA的软小麦和普通小麦的鉴别方法，通过PCR-限制性片段长度(RFLP)分析，可以实现对小麦粉中软质小麦的快速检测。与芯片毛细管电泳(LOC-CE)相结合，可以估计软小麦粉的添加比例。因此，RFLP-LOC-CE联合分析技术是鉴别软小麦粉掺假的有力工具。

基于基因中的SNP和特征序列用于已知粮油食品的掺假鉴别具有较高的准确度，但是，这种方法比较适合于对已知粮油食品原料品种的掺假鉴别，对于未知掺假物的鉴别则没有优势。而前面提到的基于色谱-质谱的代谢组学技术为扩大特征标志物筛选范围，提高掺假鉴别准确度，鉴别隐蔽掺假粮油食品，提供了新的思路。多技术的联合使用，虽检测流程更加复杂，但其鉴别准确度更高，尤其适用于单一掺假鉴别技术无法准确鉴别的情形。

5 总结与展望

通过色谱-质谱分析、矿物元素分析、稳定同位素分析和 DNA 指纹分析等找到特征标志物进行粮油食品掺假鉴别的方法有其确证性。由于粮油食品掺假方式较多，需根据食品特点选择合适的鉴别技术和特征标志物，才能达到预期的效果。高分辨色谱-质谱技术和代谢组学技术不断发展，大大扩大了特征标志物的选择范围，有较好的应用前景。根据当前的研究现状，未来有必要基于标志物建立用于不同种类粮油食品掺假鉴别的稳定、实用、有效的方法。鉴于当前粮油食品掺假方式日渐隐蔽的严峻形势，建立多种高灵敏的特征标志物的同步检测技术，促进鉴别技术的标准化、判别模型及相应数据库的信息化也是粮油食品掺假鉴别技术的主要发展方向。