长链非编码RNA FOXD3-AS1在急性髓系白血病中的表达及功能

鲁 猛，刘香来，王 芳，赵耀顺

(1.廊坊市中医医院 内科,河北 廊坊065000;2.华北石油管理局总医院 血液内科)

急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)为恶性肿瘤性疾病，患者造血功能受到抑制，随着医疗技术进步，目前临床上AML治疗效果已明显改善，但5年存活率仍然很低，严重威胁人类生命安全[1-2]。因此，研究AML发生、发展机制对AML诊疗有重要意义。长链非编码 RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是转录过程中调节因子，涉及到细胞的转录激活、细胞周期调节、核转运等多种过程[3]。越来越多的证据表明，LncRNA在多种肿瘤中被发现，与多种肿瘤发生发展有密切联系，成为新的生物标记物和治疗靶点[4]。LncRNA FOXD3-AS1是LncRNA的一种，研究发现LncRNA FOXD3-AS1在结直肠癌、乳腺癌、胶质瘤等多种恶性肿瘤中表达，与肿瘤的发生发展和患者预后有关[5]。研究表明，LncRNA FOXD3-AS1在非小细胞肺癌组织中上调表达，体外实验表明，过表达促进非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭，LncRNA FOXD3-AS1通过靶向miR-127-3p/MED28轴调控非小细胞肺癌的进展[6]。但是LncRNA FOXD3-AS1在急性髓系白血病中的确切作用机制尚不明确。本研究探讨LncRNA FOXD3-AS1与急性髓系白血病发生发展的关系，以期为寻找AML新的诊断治疗靶点提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究经过医院伦理委员会批准，所有患者或家属知情同意。选择2015年1月～2017年6月血液科收治的AML(非M3型)患者73例。其中男性40例，女性33，年龄为27-68岁，中位年龄为51岁。根据WHO分型，其中M1、M2型患者37例，M4、M5型患者36例。纳入标准：(1)诊断标准参照《血液病疗效及诊断标准》[7]关于AML的诊断标准，均经骨髓形态细胞学检查和免疫组织化学检查；(2)患者首次诊断为AML；(3)临床病理资料完整。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤者；(2)心、肝、肾等功能不全者；(3)接受过治疗的AML患者；(3)不能按时随访者；(4)临床资料不全者。

另选择同期健康志愿者75例作为对照组，男性39例，女性36例，年龄为28～70岁，中位年龄为52岁。

1.2 主要材料与试剂

人急性髓系白血病细胞Kasumi-1购自中科院上海细胞库，总RNA提取试剂盒购自Solarbio，人外周血淋巴细胞分离液(FICOLL配制)购自天津灏洋，Real-Time PCR试剂盒及SYBR Green PCR Kit购自日本Takara公司，LncRNA FOXD3-AS1及内参GADPH的引物序列购自南京金斯瑞生物科技公司。干扰LncRNA RNA FOXD3-AS1表达质粒(si-FOXD3-AS1)及对照质粒(si-NC)购自广州锐博生物科技有限公司；MTT试剂盒、Annexin V-FITC试剂盒购自索莱宝科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1标本采集

采集AML患者及对照组人员骨髓2～3 ml，加Ficoll淋巴细胞分离液，密度梯度离心得到PBMCs，冻存于-80℃冰箱保存备用，qRT-PCR法检测LncRNA FOXD3-AS1的表达。

1.3.2细胞分组及转染

将Kasumi-1细胞按照随机数字表法分为Control组、si-NC组和si-FOXD3-AS1组，每组设置6个复孔，按照Lipofectamine 2000说明书将si-NC和si-FOXD3-AS1分别转染Kasumi-1细胞，Control组不做转染处理，转染48 h后进行后续实验。

1.3.3 qRT-PCR法检测LncRNA RNA FOXD3-AS1的表达

TRIZOL法提取PBMCs总RNA，定量分析后取2 μg RNA合成为cDNA置于-20℃保存。根据试剂盒说明书在PCR仪上进行扩增，其中LncRNA RNA FOXD3-AS1正向引物序列(5′→3′)：GGTGGAGGAGGCGAGGATG，反向引物序列(5′→3′)AGCGGACAGACAGGGATTGG；GADPH正向引物序列(5′→3′)：GGTGAAGGTCGGAGTCAACG，反向引物序列(5′→3′)：CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG，反应结束后，以GADPH为内参，采用2-ΔΔCT法计算LncRNA FOXD3-AS1相对表达水平。

1.3.4MTT法检测细胞增殖

将转染后的各组Kasumi-1细胞接种于96孔板中，分别培养24、48、72 h时，使用MTT试剂盒检测细胞增殖，在490 nm酶标仪检测OD值，绘制生长曲线。

1.3.5流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡

收集转染后的各组Kasumi-1细胞，PBS洗涤后，加入70%乙醇在4℃条件下固定过夜，加入PI溶液，37℃避光孵育30 min，流式细胞仪分析细胞周期。另取各组Kasumi-1细胞，使用Annexin V-FITC试剂盒检测细胞凋亡。

1.3.6Transwell小室检测细胞迁移与侵袭

侵袭实验采用Matrigel胶包被Transwell小室上室，迁移实验不包被，用无血清培养基稀释各组转染Kasumi-1细胞，加入Transwell上室，下室加入完全培养基，培养48 h后，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，在显微镜下随机取5个视野观察，计算迁移与侵袭细胞数。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 两组观察对象PBMCs中LncRNA FOXD3-AS1表达水平

AML组患者PBMCs中LncRNA FOXD3-AS1表达水平显著高于对照组(P<0.05)。详见表1。

表1 两组观察对象PBMCs中LncRNA FOXD3-AS1表达水平

2.2 LncRNA FOXD3-AS1在AML患者PBMCs中表达与临床病理特征的关系

通过ROC曲线分析确定LncRNA FOXD3-AS1表达水平的最佳截断值为1.35，见图1。以此截断值为界，将AML患者分为高表达组(≥1.35)48例，低表达组(<1.45)25例。由分析结果可知，LncRNA FOXD3-AS1表达水平与年龄、性别、分型无关(P>0.05)，与AML患者危险度分层、WBC水平、Hb水平、PLT水平有关(P<0.05)，见表2。

图1 LncRNA FOXD3-AS1诊断AML的ROC曲线分析

表2 LncRNA FOXD3-AS1在AML患者PBMCs中表达与临床病理特征的关系 [n/(%)]

2.3 LncRNA FOXD3-AS1表达与AML患者3年总生存率的关系

LncRNA FOXD3-AS1高表达组AML患者3年存活率显著低于低表达组(48.41% vs 68.55%，χ2=5.020，P<0.05)，见图2。

图2 LncRNA FOXD3-AS1表达水平与AML患者预后关系

2.4 LncRNA FOXD3-AS1对Kasumi-1细胞增殖与凋亡的影响

与si-NC组比较，si-FOXD3-AS1组细胞增殖活性显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，表明抑制LncRNA FOXD3-AS1表达可显著抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，见图3、4与表3。

注：与si-NC比较，*P<0.05

图4 各组细胞凋亡

表3 LncRNA FOXD3-AS1对Kasumi-1细胞凋亡的影响

2.5 LncRNA FOXD3-AS1对Kasumi-1细胞周期的影响

与si-NC组比较，si-FOXD3-AS1组G0/G1期细胞比例显著升高，S期及G2/M期细胞比例显著下降(P<0.05)，表明抑制LncRNA FOXD3-AS1表达可将细胞阻滞在G0/G1期，通过调控细胞周期影响细胞增殖，见表4。

表4 LncRNA FOXD3-AS1对Kasumi-1细胞周期的影响

2.6 LncRNA FOXD3-AS1对Kasumi-1细胞迁移与侵袭的影响

与si-NC组比较，si-FOXD3-AS1组细胞迁移与侵袭数显著下降(P<0.05)，表明抑制LncRNA FOXD3-AS1表达可显著抑制细胞迁移与侵袭，见图5与表5。

图5 各组细胞迁移与侵袭

表5 LncRNA FOXD3-AS1对Kasumi-1细胞迁移与侵袭的影响

3 讨论

AML患者骨髓正常造血功能异常，以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生为主要特征，主要表现为贫血、出血、感染、全身发热等症状，部分严重患者可发生肝、脾、淋巴结等远处转移浸润，导致患者病情急重，复发率高，预后较差[8-10]，该病的具体发病机制尚不清楚。随着对LncRNA功能不断研究，LncRNA与疾病的关系逐渐受到关注[11]。LncRNA异常表达具有促癌或抑癌作用，与多种肿瘤的发生发展有密切关系，越来越多研究显示LncRNA在AML发生发展过程中发挥非常重要作用，与疾病的复发、肿瘤的转移和患者预后密切相关[12-13]。经多项研究证实，多种LncRNA与血液系统恶性肿瘤相关，如LncRNA XIST、LncRNA LINP1、LncRNA KCNQ1OT1等在AML中异常表达，与患者病情严重程度和预后有关[14-15]。LncRNA FOXD3-AS1是LncRNA其中一种，位于FOXD3启动子上游染色体1p31.3处，为启动子上游的转录物。大量研究表明LncRNA FOXD3-AS1可影响多种人类肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等多种功能，与结直肠癌、胶质瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤和乳腺癌等多种肿瘤发生发展密切相关[16-17]。有研究[18]表明，LncRNA FOXD3-AS1在多发性骨髓瘤(MM)患者血清中明显上调表达，其表达与临床分期、骨病分级和患者预后有关，是影响患者生存的独立危险因素，提示LncRNA FOXD3-AS1在多种肿瘤中发挥致癌基因作用。本研究结果显示，LncRNA FOXD3-AS1在AML患者骨髓PBMCs中高表达，明显高于健康对照组，与前人研究结果一致[18]。AML患者常伴有外周血Hb、PLT减少症，WBC含量异常增高等严重并发症，本研究分析发现，LncRNA FOXD3-AS1表达水平与AML患者危险度分层、WBC水平、Hb水平、PLT水平有关。进一步通过Kaplan-Meier生存分析发现，LncRNA FOXD3-AS1高表达组AML患者3年存活率显著低于低表达组患者存活率，表明LncRNA FOXD3-AS1高表达与患者不良预后有关。

研究显示，LncRNA FOXD3-AS1在乳腺癌中呈高表达，抑制LncRNA FOXD3-AS1表达可抑制乳腺癌细胞系增殖、迁移与侵袭[17]。在非小细胞肺癌(NSCLC)中，抑制LncRNA FOXD3-AS1表达通过靶向调节miR-135a-5p表达抑制NSCLC细胞的增殖并同时，促进细胞凋亡[18]。为研究LncRNA FOXD3-AS1在AML中的功能，本研究将si-FOXD3-AS1转染至Kasumi-1细胞，结果显示，抑制LncRNA FOXD3-AS1可Kasumi-1细胞阻滞在G0/G1期。

显著抑制Kasumi-1细胞增殖、迁移与侵袭，诱导细胞凋亡，推测LncRNA FOXD3-AS1在AML中也发挥致癌作用，其表达水平升高可促进AML的发生发展。

综上所述，LncRNA FOXD3-AS1在AML患者骨髓PBMCs中高表达，与患者危险度分层等病理特征及不良预后有关，抑制LncRNA FOXD3-AS1表达可显著抑制AML细胞增殖、迁移与侵袭，LncRNA FOXD3-AS1可能成为AML靶向治疗的标志物。然而在临床治疗中对LncRNA FOXD3-AS1表达的影响未进行深入分析，还有待进一步从多角度开展多中心、大样本研究。