宏基因组二代测序在肺部非典型病原体感染中的应用*

谢燕君，卢健聪，叶 凯，林俊鸿

惠州市中心人民医院呼吸与危重症医学科二区,广东惠州 516001

肺部感染是临床上的常见病，在一份全球死亡率分析报告中指出，呼吸道感染依然是死亡的首要缘由之一[1]。肺部感染病例中大部分无法明确致病菌，而经验性治疗往往只覆盖常见菌群。非典型病原体的定义具有广义和狭义之分，狭义上是指支原体、衣原体和军团菌，广义上是指除细菌以外的所有病原体[2]。非典型病原体如真菌、病毒、衣原体、支原体、军团菌等所致的感染治疗效果欠佳[2]，即使临床上对病原体的检出率不断提高，也改变不了肺部感染病死率高的现状，究其原因主要是病原体无法及早明确诊断。在感染性疾病中，超过30%的呼吸道感染通过传统的检测方法[直接检查、抗原抗体检测、聚合酶链反应(PCR)、分离和培养等]仍无法鉴别其病原体[3]。宏基因组二代测序(mNGS)是近年新兴的微生物检测方法，具有灵敏度高、特异性强、覆盖度广、检测能力强等优势[4]，mNGS检测对重症肺炎合并免疫缺陷患者病原体的检出率明显高于传统检测方法，而且不受使用抗菌药物种类的影响[5]。对非典型病原体的诊断，传统的检测方法能力有限，随着mNGS 的应用，有望改变这一困境。本研究将从几个方面观察mNGS在肺部非典型病原体感染中的应用价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年11月20日至2020年7月17日本院呼吸与危重症医学科收治的诊断为肺部感染性疾病并行mNGS检测的51例患者，其中女12例，男39例；年龄16～89岁，平均(61.24±18.87)岁；社区获得性肺炎35例，医院获得性肺炎16例；符合重症肺炎诊断标准13例。纳入标准：肺部感染的诊断标准遵循《内科学》第9版中的肺炎章节[6]。如果患者没有支气管肺泡灌洗禁忌证，首选肺泡灌洗液检测，如果存在禁忌证或者患者拒绝纤维支气管镜检查，则选择痰液检测，如果患者没有痰，则选择血液检测。排除标准：(1)不配合检查；(2)妊娠或哺乳期女性；(3)资料不齐全。本研究经本院伦理委员会批准(编号：KYLL2020055)，所有患者及其家属均已签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1炎症指标 所有入选的患者在入院后，使用抗感染药物前抽取静脉血，送检验科用全自动生化分析仪检测患者血常规、C反应蛋白、降钙素原等。

1.2.2传统病原体检测方法 入选患者外送行抗原及抗体检测(包括军团菌、支原体、立克次体、衣原体、腺病毒、合胞病毒、流感病毒)，特异性核酸序列检测(包括流感病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒、合胞病毒、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、军团菌、结核分枝杆菌等)，在本院行微生物的涂片、培养等，标本来源包括血液、痰液、肺泡灌洗液、咽拭子等，菌种的培养分离根据《下呼吸道感染细菌培养操作指南：WSIT 499-2017》[7]进行。

1.2.3肺泡灌洗液的采样流程 (1)部位：根据患者胸部CT影像学，选择病灶较严重的相应肺段；弥漫性改变者选择右肺中叶或左肺上叶舌段；(2)支气管镜顶端嵌顿于相应支气管段或亚段开口，经操作孔分多次注入37 ℃无菌生理盐水，总量60～90 mL，用低于100 mm Hg负压吸引获取肺泡灌洗液，总回收率≥30%；(3)弃去回收液前段可能被污染的部分，收集约5 mL立即送检。标本交由某基因公司配送和检测。

1.2.4mNGS检测 外送某基因公司，采用高通量测序技术，对标本中微生物核酸序列进行分析，通过与数据库中已有微生物的核酸序列进行比对，从而对微生物进行鉴定。检测流程包括前处理、核酸提取、合成cDNA、片段化、文库构建、测序、生物信息分析及报告解读等。基于Illumina测序高通量测序平台进行mNGS检测。质量控制要求：测序数据量≥20 M，测序读长>50 bp，去人源序列达90%以上，病原数据库>10 000种，涵盖细菌、真菌、病毒、寄生虫、分枝杆菌、衣原体和支原体多种病原微生物。

1.2.5mNGS检测结果判读 (1)若两种检测鉴定出相同微生物，则认为是致病菌；(2)若影像学提示存在病变且mNGS检测检出序列数为其他微生物的两倍，可考虑为致病菌；(3)若呼吸道标本检出结核分枝杆菌、腺病毒、流感病毒，血液标本中检出布鲁菌属，不论mNGS检出序列数如何，均可认为是致病菌[6]。

1.2.6分组标准 根据mNGS检测是否检出微生物分为检出组与未检出组。

1.3统计学处理 采用SPSS23.0软件进行数据处理和统计分析。非正态分布的计量资料以M(P25,P75)表示，两组间比较采用秩和检验。计数资料采用频数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1检出组与未检出组相关炎症指标比较 两组白细胞计数、降钙素原、C反应蛋白水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 检出组与未检出组相关炎症指标比较[M(P25,P75)]

2.2mNGS检测与传统检测方法检出率比较 51例患者中，采取传统检测方法标本显示阳性结果有24例，检出率为47.06%，而mNGS检测标本显示阳性结果45例，检出率为88.24%，mNGS检测检出率明显高于传统检测方法(χ2=19.75，P<0.05)。

2.3mNGS检测与传统检测方法对非典型病原体感染检出率比较 mNGS检测检出病毒20例(疱疹病毒7例、EB病毒10例、巨细胞病毒2例、甲型流感病毒1例)，支原体4例，衣原体1例，弯孢霉属1例，白色念珠菌14例，曲霉菌2例，马拉色菌2例，肺孢子菌5例，共30例患者检出非典型病原体感染，检出率为58.82%。传统检测方法检出曲霉菌2例，白色念珠菌5例，支原体2例，共8例患者检出非典型病原体感染，检出率为15.69%。mNGS检测对非典型病原体感染的检出率高于传统检测方法(χ2=40.60，P<0.05)。

2.4mNGS检测与传统检测方法对非典型病原体混合感染检出率比较 mNGS检测检出30例非典型病原体感染患者中，在同一患者中检出2种及以上非典型病原体的混合感染共13例；传统检测方法检出8例非典型病原体感染患者中，检出1例混合感染；mNGS检测对非典型病原体混合感染检出率高于传统检测方法(χ2=16.59，P<0.05)。

3 讨 论

相关研究表明，非典型病原体感染在肺部感染中占比逐渐上升，约22%的肺部感染致病菌为非典型病原体，且在肺部感染患者中，若初始经验性治疗覆盖非典型病原体可加快病情控制、缩短住院时间及降低病死率，但大部分患者未能接受上述治疗[8]，并且经验性治疗可导致传统检测方法对病原体的检出率下降，从而增加治疗疾病所需的费用及时间[9]，故寻找一个可供临床医生及早准确识别非典型病原体感染的方法显得尤为重要。

本研究发现，mNGS检测对总体病原体及非典型病原体的检出率均高于传统检测方法。这是因为mNGS是新一代的病原微生物鉴定方法，以序列为基础，不需要培养，通过直接提取标本中全部微生物的核酸进行高通量测序，目前mNGS检测的数据库覆盖超过10 000种病原体，能同时检测多种病原体(细菌、真菌、病毒、寄生虫、支原体、衣原体)，具有无偏倚、广覆盖的特点，能快速准确地提供病原鉴定、分型结果，拓宽检测的病原谱，提高病原体的整体检出率。传统病原体检测方法多以培养为主，耗时需要3～5 d，检出率仅有15%～20%。PCR检测与血清学检测在灵敏度、特异性和检测时效上明显优于培养法，但是其仅能基于已知的病原菌进行，检测目标局限，所能提供的信息有限，依然无法解决临床病原体检出率低的问题。除此之外，对于混合感染和未知病原体的检测是传统检测方法无法逾越的障碍。本研究发现，mNGS检测不仅对非典型病原体感染的检出率优于传统检测方法，且对于同一患者存在2种及以上病原体的混合感染的检出较传统检测方法也具有明显的优势。本研究发现，mNGS检测与传统检测方法对部分标本的检测结果存在差异，考虑可能存在以下因素：(1)标本取样时间不一致；(2)标本的取样位置存在差别；(3)mNGS检测在检测真菌和结核分枝杆菌上存在一定缺陷，存在假阴性的可能；(4)所使用的的标本类型不同，本研究中部分采用血液标本进行mNGS检测。

本研究发现，mNGS检测在多种非典型病原体的检测中存在明显优势，传统病毒检测方法中，病毒特异性抗原抗体检测的检出率偏低，PCR检测虽然可以准确检测病毒核酸，但只能检出已知的致病菌[10]，对于未知的病原体检测，mNGS检测较PCR检测具有明显优势[11]，故mNGS检测可作为传统检测方法的补充手段，有助于更快更早地定位致病菌[11-12]。本研究中，1例病毒感染患者入院时的咽拭子并未检测出甲型流感病毒感染，外送肺泡灌洗液行mNGS检测后提示甲型流感病毒感染，予抗病毒治疗后病情逐步得到控制。真菌感染多发生于免疫力低下患者，如艾滋病、器官移植、慢性消耗性疾病及服用免疫抑制药物等患者[13]。对于肺孢子菌肺炎患者，确诊需检出肺孢子菌的滋养体或包囊，本研究中mNGS检测共检出5例肺孢子菌，但传统检测方法均未能在上述标本中检出致病菌，对这类患者进行对症治疗后其病情好转并出院。在支原体、衣原体及军团菌检测方面，因其培养条件苛刻，临床中需比较恢复期血清学指标或尿抗原等进行确诊，虽然血清学检测及PCR检测的开展为其诊断提供了帮助，但需临床医生有目的性地进行检测，因此诊断较难[14]。有研究表明，mNGS检测可弥补传统检测方法在少见致病菌中检测的不足[15]，且mNGS检测范围大，检测所需时间短，仅需48 h即可得出结果，为临床下一步诊治提供参考，故mNGS检测为非典型病原体感染的诊断提供了强有力的帮助[16]。同时，mNGS检测结果受抗菌药物的影响小，可以为临床用药提供更准确地指导[17]。

综上所述，mNGS检测作为新的检测手段，目前已经在临床中广泛应用，其对非典型病原体的检出优势明显，对肺部非典型病原体感染的病原学诊断价值优于传统检测方法。虽然mNGS检测的优点很多，但是其价格昂贵，标本保存条件高，对于耐药菌的检测仍在探索中，且对于报告准确性的解读仍有待进一步提升。