miR-566与miR-1183靶向抑制RHD基因表达的研究*

王 琳，张印则，吴宗勇，岳贺佳，刘瑞琪，蔡佩佩，陈家倪，杨翠红，齐 军△

1.国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院深圳医院输血科，广东深圳 518116；2.深圳大学总医院输血科，广东深圳 518055

Rh血型系统由1p34.3-1q36.1控制编码，有54种抗原，是仅次于ABO血型的具有重要临床意义的血型系统[1-2]。RhD蛋白在Rh血型系统中免疫原性最强，因此在临床输血及母婴同种免疫中起着重要作用[3]。D抗原的变异型包括“弱D”“部分D”“DEL型”等。其中“弱D”的特征是红细胞表面D抗原位点显著性减少，但其免疫反应性不变[4]。因此，明确“弱D”表型发生的分子机制，对于准确鉴定RhD血型，指导临床输血与预防新生儿溶血病等均有重要意义。有学者发现，大部分“弱D”表型与RHD基因结构相关[5]，HOURIA等[6]认为“弱D”表型D抗原低水平是由于低水平RHD基因转录所致。

研究表明，微小RNA(miRNA)通过干预基因表达，可调节细胞的新陈代谢、分化、增殖、凋亡，其在基因的表达调控中起着重要的作用[7-8]。本研究以3例Rh“弱D”表型样本和6例RhD阳性样本为研究对象，通过生物信息学的方法筛选与调控RHD基因表达相关的miRNA，构建双荧光素酶报告基因载体，探索miRNA与RHD基因表达的关系，以期进一步研究“弱D”表型的分子机制与miRNA的关系。现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料来源 6例RhD阳性及3例“弱D”表型血液样本均来源于深圳市血液中心，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2仪器与试剂 Dual-Gloluciferase Assay system(美国Promega公司，批号：0000129139)；293T细胞株(深圳博奥康生物科技有限公司)；NotI限制性内切酶(美国Thermo公司，批号:00155534)、XhoI限制性内切酶(美国Thermo公司，批号:00209345)；质粒提取试剂盒(美国Omega公司，批号:00D6943020000C19O091)；miRNA mimcs和miRNA mimics的空白对照(广州锐博生物科技有限公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司，批号：8116402)；Lilpofectamine 2000(美国Invitrogen公司，批号:136719)；SYBR®Premix Ex TaqTM(2×)[宝生物工程(大连)有限公司，批号：AK9204]；primeSTAR HS(primix)[宝生物工程(大连)有限公司，批号：1603057]；PrimeScriptTMRT reagent Kit反转录试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司，批号：00382191]；psicheck2 vector(美国Promega公司，批号：0000095842)；miRNeasy Serum/Plasma kit(美国Qiagen公司,批号:154023933)。

1.3生物信息学预测调控RHD基因表达的miRNA 利用生物信息学软件TargetScan、PicTar和miRWalk，在线搜索可作用于RHD基因的miRNA，选择靶标率靠前的5个miRNA进行分析。

1.4双荧光素酶报告基因载体的构建

1.4.1引物 根据Pubmed Genebank ID 6007确定RHD基因3′-非编码区(3′-UTR)，采用Oligo 8.0软件设计聚合酶链反应(PCR)引物，RHD-3UTR-F:CCCTCGAGCCGCCTGCATTTG-TACGTGAG；RHD-3UTR-R:GAATGCGGCCGCACAAGCACTGCCACGTTCAC(上海生工生物科技有限公司合成)。

1.4.2PCR合成RHD基因3′-UTR片段 以人基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50 μL：2×primeSTAR HS(primix) 25 μL，模板100 ng，上游引物(100 μmol/L)0.4 μL，下游引物(100 μmol/L)0.4 μL，加双蒸水(ddH2O)至50 μL。设置PCR反应条件为：98 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸75 s，30个循环。

1.4.3载体构建 将上述PCR产物纯化后进行NotI/XhoI双酶切，与双荧光素酶报告基因载体psicheck2连接，然后转化至DH5α感受态细胞。随机挑取克隆放大培养后提取质粒DNA。

1.4.4酶切验证及测序 把提取的质粒DNA用NotI和XhoI做双酶切处理，用琼脂糖凝胶电泳验证RHD基因3′-UTR序列是否成功插入载体；选取酶切验证正确的克隆进行测序。

1.5报告基因载体与miRNA mimics共转染细胞 用DMEM培养基于37℃，5% CO2的条件下培养293 T细胞。96孔板，100微升/孔，1.5×104个/孔，培养24 h。取浓度为10 μmol/L的5个miRNA mimics和miRNA mimics的空白对照(miRNA-NC)各1 μL，分别与9 μL OPTI-MEM培养基混合；取100 ng/μL的靶基因3′-UTR报告基因载体2 μL，与13 μL OPTI-MEM培养基混合；取1 μL Lipofectamin 2000与24 μL OPTI-MEM培养基混合。5 min后三者混合，共50 μL。轻轻摇匀静置20 min，然后加至细胞内。做3个平行孔。转染48 h后加入底物，测定荧光值。

1.6实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miRNA的表达 提取9个样本的RNA，将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，荧光定量检测miRNA的表达量。正向引物为：miRNA566-GGGCGCCTGTGATCCCAAC，miRNA1183-CACTGTAGGTGATGGTGAGAGTG，miRNA1207-TGGCAGGGAGGC TGGGAG。20 μL反应体系：SYBR®Premix Ex TaqTM(2×) 10 μL，正向引物(10 μmol/L)0.4 μL，反向通用引物(10 μmol/L)0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，cDNA模板 0.4 μL，ddH2O 8.4 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 12 s，60 ℃ 34 s，40个循环，每个样本及内参(U6)进行3次重复，阴性对照以ddH2O代替cDNA模板进行熔解曲线检测。miRNA相对表达量的计算采用2-ΔΔCt法计算。

2 结 果

2.1调控RHD基因表达的miRNA 生物信息学预测的靶标率靠前的5个调控RHD基因表达的miRNA分别为miR-566、miR-939、miR-1183、miR-1207和miR-1222。

2.2双荧光素酶报告基因载体的构建 成功构建了RHD基因3′-UTR双荧光素酶报告基因载体，将该报告基因载体命名为priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR。PCR合成的RHD基因3′-UTR序列，经琼脂糖凝胶电泳鉴定结果见图1，扩增片段1 200 bp与理论值相符。克隆后挑取6个单菌落经PCR验证，片段长度为1 200 bp，证明目的片段已成功插入载体，结果见图2。在6个单菌落中选取3个单菌落扩大培养提取质粒DNA，双酶切priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR，得到2个条带，RHD基因3′-UTR片段与预期大小相符，见图3。priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR的测序图显示其RHD基因3′-UTR序列与参考序列完全一致。

注：M为Marker；1为PCR扩增产物。

注：M为marker；1～6为6个菌落的PCR产物；7为阴性对照；8为阳性对照。

注：M为marker；1～3为priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR的双酶切产物。

2.3miRNA与RHD基因的靶点验证结果 priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR与miR-566、miR-939、miR-1183、miR-1207、miR-1222共转染细胞的相对荧光素酶活性分别为0.63±0.02、1.08±0.18、0.87±0.11、0.86±0.05、0.99±0.01。转染miR-566、miR-1183、miR-1207可以使priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR的相对荧光素酶活性较miRNA-NC分别降低37%、13%、14%(P<0.05)，而miR-939与miR-1222没有使该载体的相对荧光素酶活性降低。见图4。

注：与miRNA-NC比较，*P<0.05。

2.4qRT-PCR定量测定miRNA的差异表达 双荧光素酶报告基因实验发现，miR-566、miR-1183和miR-1207对RHD基因3′-UTR有靶向作用,于是检测miR-566、miR-1183和miR-1207在RhD阳性及“弱D”表型样本中的相对表达量。结果显示，miR-566和miR-1183在“弱D”表型样本中的相对表达量明显高于RhD阳性样本(P<0.05)，见图5。

注：与RhD阳性样本比较，*P<0.05。

3 讨 论

miRNA是由20～25个核苷酸组成的非编码小分子RNA，它能通过碱基互补配对方式识别靶信使RNA(mRNA)，并且根据互补程度的不同指导沉默复合体阻遏靶mRNA的翻译或者降解靶mRNA，进而发挥相应的生物学作用[9]。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以有同一个靶基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。miRNA参与多种调节途径，包括发育、造血过程、病毒防御、脂肪代谢、器官形成、细胞增殖和凋亡等[10]。

Rh血型系统是人类红细胞血型系统中最复杂、最重要也是最富有多态性的一个系统，D抗原是人RHD基因表达的最重要的抗原。RHD基因变异较多，其中“弱D”是其编码D抗原数量较少[11-12]。miRNA可以通过部分互补结合到目的mRNA的3′-UTR，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，因而可能成为调控Rh血型系统的“弱D”表型表达的关键分子。

本研究利用生物信息学方法分析预测潜在靶向调节RHD基因表达的miRNA。在此基础之上，笔者构建了RHD基因3′-UTR双荧光素酶报告基因载体priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR，将预测的miR-566、miR-939、miR-1183、miR-1207、miR-1222和priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR共转染293 T细胞，研究其相对荧光素酶活性变化。结果表明，miR-566能使priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR的相对荧光素酶活性降低37%，对其有明显的抑制作用(P<0.05)，miR-1183、miR-1207亦使priR-RB-REPORT-RHD-3′-UTR的相对荧光素酶活性分别降低13%(P<0.05)和14%(P<0.05)，说明miR-566、miR-1183和miR-1207潜在靶向调控RHD基因3′-UTR。于是笔者在RhD阳性及“弱D”表型两组样本中检测了miR-566、miR-1183、miR-1207的表达，发现miR-566和miR-1183在“弱D”表型样本中的相对表达量明显高于RhD阳性样本(P<0.05)。因而推测miR-566、miR-1183能下调RHD基因的表达，这可能是使Rh血型系统“弱D”表型出现的相关分子机制。但为什么miR-1207在“弱D”表型和RhD阳性样本中的相对表达量差异无统计学意义还有待进一步研究[13]。此外，有报道称，miR-566通过调控WNT6而影响乳腺癌的进展[14]；而miR-1183对胶质瘤细胞可能存在调控作用[15]。

miR-566与miR-1183在“弱D” 和RhD阳性标本中的相对表达量的显著差异，为在miRNA水平研究Rh血型中“弱D”表型的分子机制奠定了基础，同时为RhD阳性与“弱D”表型间的鉴别提供了新的分子检测方法。

综上所述，本研究成功构建了RHD基因3′-UTR的双荧光素酶报告基因载体，同时初步证明RHD基因的3′-UTR与miR-566、miR-1183和miR-1207有结合靶点，且在“弱D”表型样本中发现miR-566和miR-1183的高表达，初步证明了miR-566和miR-1183能调控RHD基因的表达，为进一步研究调控RHD基因表达的分子机制提供了理论依据。