腹腔感染高毒力肺炎克雷伯菌的临床与分子特征分析*

王丽萍,邵春红,范 会,周 正,仝 艳,金 炎△

1.山东省公共卫生临床中心病原微生物实验室，山东济南 250100;2.山东第一医科大学附属省立医院医学检验部，山东济南 250002

肺炎克雷伯菌(Kpn)是克雷伯菌属中最重要的一类菌，可诱发重症肺炎、肝脓肿、肺脓肿和尿路感染等。资料显示，Kpn已取代大肠埃希菌成为腹腔感染最常见的致病菌[1]。根据毒力特点的不同，可将Kpn分为普通Kpn(cKp)和高毒力Kpn(hvKp)。hvKp因不仅能对健康宿主造成侵袭性感染，还能引起特殊部位的感染，而受到全球关注[2]。为进一步认识hvKp，本研究对腹腔感染hvKp患者的临床及其分子特征进行分析。现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料来源 收集山东第一医科大学附属省立医院(以下简称本院)2019年1月至2020年10月腹腔感染患者分离的Kpn和其他部位感染分离的Kpn(剔除同一患者分离的重复菌株)，对腹腔感染患者的病历进行临床资料总结和分析。Kpn来源患者共84例，其中男54例，女30例；年龄18～86岁，根据拉丝试验结果分为hvKp组和cKp组，对两组患者临床资料进行分析。

1.2仪器与试剂 VITEK MS全自动快速微生物质谱分析仪(法国生物梅里埃有限公司)，VITEK 2 Compact 全自动微生物分析仪及配套药敏卡(AST-GN13) (法国生物梅里埃有限公司)，TC-96PCR仪(杭州博日科技有限公司)，Power Pac Basi电泳仪(美国伯乐公司)，血平板、麦康凯平板、MH平板、药敏纸片(美国赛默飞世尔科技公司)。

1.3方法

1.3.1细菌鉴定及药敏试验 采用VITEK MS全自动快速微生物质谱分析仪进行细菌鉴定；采用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪(药敏卡AST-GN13)联合纸片扩散(K-B)法进行药敏试验。药敏结果参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)2019年版标准[3]进行判读。

1.3.2hvKp菌株筛选 采用黏液表型检测(拉丝试验)进行筛选，将冻存菌株用血琼脂平板转种，置于CO2恒温箱，37 ℃培养18～24 h，用灭菌接种针轻放于单个菌落上，慢慢向上挑起菌落，如果有黏液丝形成，且长度≥5 mm，则拉丝试验阳性，判定为hvKp；反之，则拉丝试验阴性，判定为cKp[4]。

1.3.3毒力水平检测 取经过夜培养的hvKp和cKp新鲜菌落，配制成浓度为1×104菌落形成单位(CFU)/mL、1×106CFU/mL、1×108CFU/mL的菌悬液，取每种菌悬液10 μL分别注入大蜡螟尾部的第二和第三对足之间(每个浓度10只)，以注入生理盐水为对照组，幼虫在37 ℃孵育4 d，每12 h观察并记录大蜡螟的存活情况。

1.3.4血清分型及毒力基因检测 用煮沸法提取细菌的模板DNA，引物委托上海生工生物工程有限公司合成，血清型引物参照文献[5-6]，毒力基因引物序列见表1，聚合酶链反应扩增后，将阳性产物送至上海生工生物工程有限公司测序，结果在NCBI网站上运用BLAST比对确定其基因型。

表1 荚膜血清分型及毒力基因引物序列

2 结 果

2.1hvKp确认 腹腔感染患者分离的84株Kpn，其中43株拉丝试验阳性，判定为hvKp，阳性率为51.19%；41株拉丝试验阴性，判定为cKp。

2.2毒力水平检测 hvKp和cKp的半数致死量分别为每只大蜡螟1×104CFU/mL和每只大蜡螟1×106CFU/mL，对照组大蜡螟24 h仍然存活，当给菌剂量为1×108CFU/mL时，hvKp组大蜡螟24 h的存活率为58.75%，cKp组大蜡螟24 h的存活率为82.86%，hvKp组与cKp组和对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

图1 毒力水平检测

2.3血清分型结果 腹腔感染患者分离的Kpn中共30株检出常见的血清分型，其中以K1型为主，检出16株(19.05%)，其次为K2型，检出11株(13.10%)。hvKp组K1型的检出率高于cKp组(P<0.05)。见表2。

表2 荚膜血清分型比较

2.4毒力基因检测 腹腔感染患者分离的Kpn中，毒力基因以peg-344和icuA为主(61.90%、54.76%)。hvKp组peg-344、icuA和rmpA的检出率均高于cKp组(P<0.05)。见表3。

表3 毒力基因分布比较

2.5耐药性 hvKp和cKp对常用抗菌药物的耐药率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，但腹腔感染患者分离的Kpn与同时期本院其他来源的Kpn的药物敏感率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 抗菌药物耐药性比较(%)

2.6临床特征 hvKP组和cKp组的年龄，住院时间，性别，感染来源，是否入住ICU，生活习惯，临床诊断(肾脓肿、其他感染)，基础疾病(高血压、心脏病)，临床用药(除出院带药)患者比例比较差异无统计学意义(P>0.05)，而hvKP组临床诊断中肝脓肿、胆囊感染，基础疾病中糖尿病、肿瘤和临床用药中出院带药患者比例均高于cKp组(P<0.05)。见表5。

表5 hvKp与cKp感染患者临床特征比较

续表5 hvKp与cKp感染患者临床特征比较

2.7危险因素分析 结合单因素分析结果，将肝脓肿、胆囊感染、糖尿病、肿瘤和出院带药作为自变量，hvKp感染作为因变量。多因素Logistic回归分析结果显示，糖尿病是hvKp感染的独立危险因素(P<0.05)，见表6。

表6 hvKp感染多因素Logistic回归分析

3 讨 论

Kpn是引起医院获得性感染和社区获得性感染常见的细菌，可造成多部位感染[7]。hvKp具有高黏性和高致病性[8]。与cKp感染不同的是，其可感染无基础疾病的年轻人，且易发生转移感染，导致其他多部位和组织的感染，在临床受到高度关注。通过大蜡螟毒力水平检测发现，在相同的给菌剂量下，hvKp组大蜡螟存活率明显低于cKp组和对照组，在给菌剂量1×108CFU/mL，经过24 h，hvKp组的存活率为58.75%，而对照组仍然全部存活，这显示了hvKp组的毒力水平较高，印证了hvKp的高毒力性。

腹腔感染患者分离的Kpn以K1型为主，检出率为19.05%(16株)，其次为K2，检出率为13.10%(11株)，此外还检出2株K20和1株K57，未检出K5和K54。hvKp与cKp两组比较，K1型检出率差异有统计学意义(P<0.05)，这与以往研究结果一致[9]，K1型在hvKp感染中最常见，且与肝脓肿密切相关。但本研究共有54株(64.29%)Kpn未检出常见的血清分型，这说明导致腹腔感染的Kpn可能存在其他血清分型。

毒力基因检测以peg-344和icuA检出率较高，其次是rmpA和wabG。hvKp与cKp两组比较，peg-344、icuA和rmpA检出率差异均有统计学意义(P<0.05)。rmpA是经质粒介导的细胞外调节多糖因子，能促进Kpn荚膜基因和高黏表型的表达，但有研究发现，rmpA不能独立发挥作用，必须与碲酸盐抗性因子、银抗性因子以及需氧菌素铁离子复合体受体等共同作用[10]。iucA位于Kpn毒力质粒上，对高毒力表型起至关重要的作用，可作为鉴别hvKp和cKp的遗传标志物[11]。peg-344是近年来新发现的毒力基因，存在于hvKP毒力质粒上[12]，且有报道显示，peg-344是hvKp特有的，可用于hvKp快速诊断试验[5]。单独以peg-344判定hvKp，其准确度为97%、灵敏度为99%、特异度为96%；单独以icuA判定hvKp，其准确度为96%、灵敏度为99%、特异度为94%；而二者联合则准确度可以提高到98%、灵敏度为94%、特异度达100%[5]。此外，还有文献报道，联合大蜡螟毒力水平检测，其灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值可提高到95.56%、94.83%、93.48%和96.49%[13]。

hvKp对除头孢唑啉和氨苄西林/舒巴坦外的普通抗菌药物均表现为100.00%的敏感率，且hvKp较cKp有更高的敏感率，这与SHAH等[9]报道的基本一致，这可能是因为hvKp菌株不能获得相关的耐药质粒，或者是某些耐药基因在普通菌株转变为高毒力菌株的过程中丢失[8]。虽然本研究未发现多重耐药或特殊耐药的菌株，但是近年来报道的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的hvKp和耐碳青霉烯类的hvKp(cr-hvKp)菌株越来越多，产ESBLs的hvKp是比较重要的耐药菌株，有更好的传播效应，而cr-hvKp具有超强毒力、多重耐药性、传播性强等特点，给临床治疗带来更大的挑战，临床应加强重视，积极早期治疗、预防耐药菌株的产生[14-15]。

本研究中，hvKP组肝脓肿及胆囊感染患者比例高于cKp组，这可能与hvKp比cKp更容易引起肝脓肿及胆囊感染有关，hvKp感染多以原发性肝脓肿为首要症状，这与CUBERO等[16]的研究结果基本一致。经多因素Logistic回归分析，糖尿病是hvKp感染的独立危险因素，这主要与糖尿病患者自身免疫功能低下密切相关，与文献报道一致[17-18]，在高糖的情况下机体的免疫系统易遭到破坏，进而使hvKp荚膜多糖合成能力大大提高，从而使细菌侵袭及抵抗中性粒细胞吞噬的能力得到增强。此外，本研究中，hvKP组肿瘤患者比例高于cKp组，结合临床资料分析，肿瘤也是hvKp感染的易感因素，这可能与肿瘤患者自身免疫功能低下有关[19]。

由于hvKp耐药率较低，临床主要选择头孢菌素类抗菌药物，并且辅以经皮穿刺引流脓液治疗，但与cKp感染不同的是，hvKp感染患者中有41.86%的患者出院后带药继续治疗，这主要是由于hvKp感染痊愈数周或数月后可能会复发，因此对于hvKp感染患者，可以静脉输液治疗3～4周后，继续口服抗菌药物3～4周以防止复发[18-19]。

现阶段临床诊治中并未区分hvKp和cKp感染，但hvKp的高侵袭性及潜在的严重后遗症和耐药性，在将来可能成为人类健康的重大威胁。虽然hvKp对大部分抗菌药物敏感，但明确hvKp感染有利于对转移灶的治疗和防止复发，避免出现严重后遗症和高耐药性菌株。分析本院腹腔感染hvKp的药物敏感性及临床特征，可以帮助临床医生增加对hvKp的认知，从而为下一步预防及治疗提供借鉴。