miR–100通过Akt/mTOR信号通路对胃癌细胞增殖的负调控作用

郭利华 胡桂梅 丁 勇 王静静 叶国良

宁波大学医学院附属医院消化内科，浙江宁波 315020

miR–100 位于人染色体11q24.1，主要参与基因转录后调控，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡等细胞信号途径，与正常组织比较，miR–100 在肿瘤组织中表达异常[1-3]。课题组前期研究发现，胃上皮细胞感染幽门螺杆菌后miR–100 表达异常，与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）相关信号通路相关[4]，进一步对胃癌细胞系进行miR–100 检测，发现胃癌细胞miR–100 较胃黏膜上皮细胞表达下降，考虑miR–100 可能参与胃癌发展进程。miR–100 作为miR–99 家族中的重要成员，研究已证实其与肿瘤的发展进程密切相关，在多种恶性肿瘤中发现miR–100 表达降低[1,3,5]。mTOR 是miR–100 靶基因之一，miR–100 可通过调控mTOR等靶基因表达发挥抑癌作用[4,5]。本项目拟采用miR–100 模拟剂转染BGC–823 细胞，检测miR–100对胃癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及对蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/mTOR 信号通路的影响，探讨胃癌细胞增殖、凋亡与 miR–100 调控Akt/mTOR 信号通路之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌细胞株BGC–823、SGC–7901、MKN–45和人正常胃黏膜上皮细胞株GES–1 均购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT–PCR）引物购于生工生物工程（上海）股份有限公司；转染试剂mimics、inhibitor、mock及mTOR–WT、mTOR–MUT 购于Invitrogen 公司；RPMI–1640、MEM、DMEM 培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购于Invitrogen 公司；Total RNA抽提试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公司；逆转录试剂盒PrimerScript RT Master Mix 购于Spark Jade 公司；RIPA 裂解液购于Spark Jade 公司；CCK–8 试剂盒、Annexin V–FITC 凋亡试剂盒购于Bioss 公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；一抗及二抗均购于CST公司。

1.2 细胞转染

选择对数生长期的BGC–823 细胞种植于6 孔板中（每孔3×104～5×104个）；将miR–100 模拟剂（mimics）、对照（mock）和LipofectamineTM2000试剂分别稀释至适量的Opti–MEM无血清培养基中，在室温下放置5min。将miR–100 mimics 和对照组分别与LipofectamineTM2000 转染试剂混合，室温下放置20min。最后将转染复合体（siRNA–LipofectamineTM2000 复合物）分别加入每一个包含50%～60%细胞的培养孔中。在培养箱孵育，按相应实验需要收集细胞。

1.3 CCK–8 实验

细胞转染后，向96 孔板加入细胞100μl/孔（约1×103个）。放入细胞培养箱中培养24h、48h 及72h，向各孔加入10μl 的CCK–8 细胞增殖检测溶液，培养箱中孵育2h，使用伯乐酶标仪在450nm 波长处检测每孔的吸光度值。每组共设置5 个复孔，计算平均吸光度值，绘制细胞生长曲线。

1.4 细胞周期

细胞转染72h 后，将各组细胞用胰蛋白酶消化，细胞离心后接着用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）洗涤2 次，每次1000g 离心5min；弃上清后用预冷的70%的乙醇固定，4℃过夜；细胞离心后去除乙醇，PBS 洗涤2 次，然后加5μl 的RNA酶（5g/L），室温条件下处理15min；每管内加5μl的碘化丙啶（propidiumIodide，PI）染色液，室温避光情况下孵育30min；1h 内流式检测，应用ModFit LT™软件分析细胞周期结果。

1.5 细胞凋亡

细胞转染72h 后，将各组细胞用胰蛋白酶消化，收集5×105个细胞，以PBS 洗涤，加入400μl 的Binding Buffer，将细胞混匀，再添加5μl 的Annexin V–FITC 溶液，混匀后于4℃避光反应15min，加入PI 染色液，继续在4℃反应10min。用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。

1.6 定量反转录聚合酶链反应

用Trizol 裂解液萃取细胞总RNA，测浓度后反转录为互补DNA，用miScript SYBR Green PCR kit进行实时定量反转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT–PCR）检测，反应条件：预变性95℃ 30s，PCR反应95℃ 5s，60℃ 34s，共40 个循环。应用2–∆∆Ct法测定基因的相对表达量，以U6、GAPDH 为标准内参，每组设置3 个复孔，所用引物见表1。

1.7 靶基因预测及双荧光素酶报告基因验证

将miR–100 的mimics 或其空载体与载有野生型mTOR–WT 质粒或空变型mTOR–MUT 质粒共转染BGC–823 细胞，转染48h 后收集细胞，通过酶标仪检测细胞荧光素酶活性，以海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶活性比值判断细胞活性。

1.8 蛋白质印迹法

用RIPA 裂解液抽取细胞总蛋白，BCA 法测定总蛋白浓度。蛋白样品中添加5×Loading buffer 放入沸水中5min 使其变性。每孔加入等量的蛋白样品，恒压电泳，取出已完成电泳的SDS–PAGE 胶，将蛋白转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉溶液中封闭1h 后，PVDF 膜加入一抗，在4℃冰箱过夜，TBST 洗膜，然后在室温下孵育二抗1h，TBST 洗膜，ECL 显色，X 光片曝光、显影，GAPDH 作为内参，结果分析。

1.9 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件对数据进行分析处理。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用One–way ANOVA 分析，组间两两比较采用LSD–t检验，两组间比较采用t检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌细胞株miR–100 表达降低

胃黏膜上皮细胞株 GES–1 与胃癌细胞株BGC–823、SGC–7901、MKN–45 的miR–100 相对表达量依次为0.998±0.221、0.386±0.043、0.690±0.072、0.494±0.057，胃癌细胞株miR–100 表达量均显著低于胃黏膜上皮细胞株（F=13.727，P=0.002），见图1。miR–100 在BGC–823 中表达水平最低，因此选择BGC–823 进行后续研究。

图1 胃癌细胞株与胃黏膜上皮细胞株miR–100 表达水平比较

2.2 转染miR–100 对BGC–823 胃癌细胞增殖的影响

miR–100 mimics 组miR–100 表达水平显著高于对照组（P<0.01）。miR–100 mimics 组48h 450nm 的吸光度值显著低于对照组[（0.823±0.059）vs（1.133±0.112），t=4.894，P=0.003]，72h 450nm 的吸光度值显著低于对照组[（1.017±0.075）vs（1.343±0.112），t=6.937，P<0.001]，见图2。

图2 转染miR–100 对BGC–823 细胞增殖的影响

2.3 转染miR–100 对BGC–823 细胞周期的影响

miR–100 mimics组G0/G1期细胞比率显著高于对照组[（65.59%±0.86%）vs（55.82%±0.64%），t=15.865，P<0.001]，S 期细胞比率显著低于对照组[（23.98%±1.24%）vs（27.02%±0.81%），t=6.324，P=0.003]，G2/M 期细胞比率显著低于对照组[（10.32%±1.82%）vs（17.15%±0.45%），t=3.553，P=0.024]，见图3。

图3 转染miR–100 对BGC–823 细胞周期的影响

2.4 转染miR–100 对BGC–823 细胞凋亡的影响

miR–100 mimics 组细胞凋亡率（11.26%±1.46%）略高于对照组（9.05%±1.23%），但两组间比较差异无统计学意义（t=2.594，P=0.060），见图4。

图4 转染miR–100 对BGC–823 细胞凋亡的影响

2.5 miR–100 靶基因双荧光素酶报告基因验证

在转染克隆有mTOR–WT 基因3'UTR 质粒的实验中，miR–100 mimics 组细胞荧光素酶活性显著低于对照组[（0.46±0.05）vs（1.05±0.08），t＝10.780，P<0.001]；在转染克隆有mTOR–MUT 基因3'UTR质粒的实验中，miR–100 mimics 组和对照组荧光素酶活性比较差异无统计学意义[（1.01±0.07）vs（0.95±0.06）；t＝1.540，P=0.198]，见图5。

图5 双荧光素酶报告基因检测miRNA‐100 对靶基因mTOR 调控作用

2.6 miR–100 对BGC–823 胃癌细胞Akt/mTOR 表达的影响

BGC–823 细胞转染72h 后，胃癌细胞中Akt、mTOR、p70S6K mRNA 及蛋白表达均显著降低（P<0.05），而PI3K mRNA 及蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），见图6。

图6 BGC–823 细胞转染72h 后Akt/mTOR 信号通路表达变化

3 讨论

研究显示miR–100 影响肿瘤细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等生物学过程[2,6-8]。Cao 等[3]研究发现与癌旁组织相比，胃癌组织中miR–100 表达水平显著降低；Peng 等[9]发现与正常胃黏膜上皮细胞GES–1比较，数种胃癌细胞株如SUN–1、AGS 及HGC–27的miR–100 表达水平显著降低，本研究结果显示胃癌细胞株miR–100 表达水平显著低于胃黏膜上皮细胞株，与既往研究结果相符，提示miR–100 可能参与胃癌的发病过程。

通过细胞转染技术，将miR–100 模拟剂转染至人胃癌细胞BGC–823，结果发现，转染48h、72h 后细胞增殖率较对照组显著降低，表明miR–100 可降低胃癌细胞增殖活性。Ye 等[10]研究证实miR–100–5p模拟剂可抑制前列腺癌LNCaP、PC–3 细胞系的增殖活力，同时还可抑制LNCaP、PC–3 细胞的侵袭与迁移。流式细胞仪检测分析结果提示，转染后胃癌细胞周期停滞在G0/G1期，S 期及G2/M 期细胞比率明显下降，表明miR–100 转染使胃癌细胞周期发生变化。Peng 等[9]研究发现AGS 胃癌细胞株miR–100 过表达可促进细胞凋亡，而MGC–803 胃癌细胞株miR–100 低表达对细胞凋亡无明显影响。推测miR–100对细胞凋亡的影响可能与胃癌细胞分化程度有一定相关性，本研究结果提示miR–100 mimics 组细胞凋亡率虽略高于对照组，但两组比较差异无统计学意义。因此，miR–100 对胃癌细胞凋亡的影响仍有待进一步研究。

TargetScan 分析发现miR–100 有包括mTOR、FZD5、FZD8、IGF1R 在内的多个靶基因，阅读相关文献，以上靶基因与胃癌均有相关性。Lin 等[11]通过双荧光素酶报告实验证实mTOR 是miR–100 的目的基因之一。因此本研究将mTOR 作为目的基因，通过荧光报告验证野生型mTOR 转染后荧光活性明显受抑制，mTOR 表达下调明显。因此，可认为mTOR是miR–100 转录后调控的重要靶基因。

mTOR 是Akt 下游关键底物之一，研究发现胃癌组织中Akt/mTOR 信号通路相关基因也存在异常表达，Akt/mTOR 异常活化可导致胃癌细胞恶性增殖、凋亡受阻、周期转运加速，并促使肿瘤血管再生和细胞侵袭转移[12,13]。Akt/mTOR 信号通路参与细胞转录翻译、细胞周期、凋亡及血管新生等肿瘤细胞生物学过程[14]。在脑肿瘤、乳腺癌、卵巢癌等研究中发现Akt/mTOR 蛋白酶链式反应能加速细胞周期、相对缩短G1期，使细胞增殖异常活跃，减少细胞凋亡，从而促进肿瘤迅速生长[15-17]。mTOR 激活可使下游核糖体S6 蛋白激酶（p70S6K）磷酸化，促进蛋白质合成[16]。本研究发现胃癌细胞株BGC–823转染后，Akt/mTOR 信号通路Akt、mTOR、p70S6K基因及蛋白表达明显降低，而Akt、mTOR 及p70S6K是细胞增殖、细胞周期调控等细胞进程中的重要分子，影响这些基因及蛋白的表达势必影响细胞的增殖、细胞周期等活动，而miR–100 mimics 具有抑制细胞增殖、阻滞细胞周期进程的作用。

综上，miR–100 在胃癌细胞中低表达，miR–100 靶向调控mTOR 抑制胃癌细胞增殖，阻碍细胞周期进程，可能与调控Akt/mTOR 信号通路相关蛋白表达有关。