丙酮酸激酶M2型在恶性肿瘤中的表达及其临床检测研究进展

程燕妮，刘 佳，袁 野，张德太， 王 琳

(华中科技大学同济医学院附属协和医院 a.检验科；b.再生医学中心；c.胃肠外科， 湖北 武汉 430022)

有氧糖酵解是肿瘤细胞的重要特征之一。在有氧条件下，正常细胞通常以有氧呼吸的方式消耗葡萄糖。然而，肿瘤细胞仍然进行活跃的糖酵解，这种代谢特征被称为Warburg效应[1]。肿瘤细胞的有氧糖酵解与其多种生物功能密切相关，越来越多的研究者开始从异常代谢的角度探索肿瘤发生发展和转移的分子机制。

多篇文献报道[2-4]，丙酮酸激酶M2型(PKM2)高表达于乳腺癌、胃癌等多种癌症患者的肿瘤组织、血液以及分泌物中，其表达水平与患者的临床表现密切相关，能够用于对患者病情及预后进行评估，具有临床检测价值。随着对PKM2研究的深入，PKM2在肿瘤组织中的作用越来越受到重视。探讨PKM2在肿瘤发生发展中的作用机制还能够为肿瘤的临床治疗提供新的思路。本文基于PKM2在各系统肿瘤的发生机制及临床筛查、诊断和治疗中的价值，以及临床检测方法进行了综述。

1 PKM2的生物学特性

丙酮酸激酶是糖酵解过程的重要限速酶之一，主要作用是将磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和二磷酸腺苷(ADP)转变成丙酮酸，并释放大量三磷酸腺苷(ATP)，在糖酵解过程中起到关键作用。丙酮酸激酶有4种同工酶，分别在特定的组织或细胞中表达。其中，PKM2与肿瘤细胞的Warburg效应密切相关，在肿瘤异常代谢中扮演重要角色。

PKM2最初高度表达于快速增殖的胎儿组织和干细胞中，与组织修复和再生密切相关，并在胚胎发育成熟的过程中逐渐消失。然而，PKM2在肿瘤发生过程中再次出现。PKM2在肿瘤细胞的糖代谢中起到限速酶的作用，并通过参与有氧糖酵解积累糖酵解中间产物，为肿瘤细胞提供快速增殖的原料，促进肿瘤的形成、侵袭及转移[1, 5]。此外，PKM2还能够与其他糖代谢关键酶一同调节肿瘤细胞的能量代谢及线粒体重编程[6]。

2 PKM2与各系统肿瘤的关系

2.1头颈部肿瘤 头颈部恶性肿瘤是我国常见的恶性肿瘤之一，其中超过90%为鳞状细胞癌。PKM2在舌[7]、口腔鳞状细胞癌[8]及人胶质母细胞瘤中均高度表达，与不良临床病理学特征显著相关。在口腔鳞状细胞癌中，PKM2可通过调节癌细胞中活性氧的产生和谷氨酰胺与乳酸之间的整合，调控细胞能量代谢，促进肿瘤的生长、侵袭[8]。PKM2还可调节人胶质母细胞瘤的细胞周期进程和细胞生长，影响细胞侵袭和克隆形成能力[9]。以上研究表明，PKM2在头颈部肿瘤中发挥着致瘤和促瘤作用，可能是潜在的预测指标和治疗靶点。

2.2胸部肿瘤 在全球范围内，肺癌是发病率及死亡率最高的一类恶性肿瘤，临床上的主要亚型为非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC)，其中40%以上为肺腺癌[10]。绝大多数NSCLC患者在确诊已经发生转移，放疗和化疗效果差，亟需寻找肺癌的早期诊断标志物及治疗靶标。PKM2在肺腺癌患者的原发及转移灶组织中的表达水平显著上调，与肿瘤细胞的分化程度及恶性程度密切相关[11]。Guo等[12]对173例原发肺腺癌组织样本进行免疫组化染色，结果显示，PKM2与患者的TNM(tumor node metastasis classification)分期密切相关(P=0.005)，PKM2高表达患者的总生存期(overall survival，OS)(P<0.01)和无病生存率(disease free survival，DFS)(P=0.050)显著短于低表达患者。敲低肺癌细胞中PKM2的表达能够显著降低细胞的葡萄糖摄取能力，明显抑制细胞增殖和侵袭[11]。同时，调控PKM2还可对细胞的放疗[13]和化疗[14]敏感度产生显著的影响，为NSCLC的治疗提供了新思路。

PKM2在乳腺癌及食管癌组织中表达升高，与在肺癌中的作用相似，监测和靶向PKM2有助于预测患者的化疗反应和逆转肿瘤细胞的化疗耐药。在乳腺癌中，PKM2表达与肿瘤大小呈负相关(P=0.008)，与淋巴结分期呈正相关(P=0.047)，PKM2高表达预示着较差的无进展生存(progression-free survival，PFS)和OS[2]。抑制耐药性乳腺癌细胞内PKM2表达可显著增强细胞对多柔比星及5-氟尿嘧啶等化疗药物的敏感度[2, 15]。在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)中，PKM2表达与患者的化疗敏感度呈显著的负相关(P=0.0342) ，下调PKM2有利于增强顺铂化疗效果[16]。双氢青蒿素等药物也可以通过下调PKM2对ESCC起到治疗作用[17]。

2.3腹腔肿瘤 目前，胃镜和病理活检是最常用的胃癌早期诊断方法，检测费用高，取样过程繁琐、侵入性强，限制了胃癌的大规模筛查和早期诊断。寻找有意义的生物标志物可为筛查胃癌高危人群和早诊断早治疗提供重要参考。研究发现，胃癌组织中的PKM2表达水平自胃癌早期阶段就明显增高[3]，与淋巴结转移(P=0.049)、肿瘤侵袭(P=0.007)和TNM分期(P=0.001)呈正相关[4]。胃癌细胞中PKM2表达的下调能够明显抑制细胞增殖和迁移[4]，可能是胃癌患者的潜在治疗靶点。

据统计，2020年结直肠癌成为全球新发病例第三位的肿瘤。由于结直肠癌发病早期无明显症状，发展相对缓慢，早期容易被忽视。随着对结直肠癌发病机制的进一步探索， PKM2成为研究的焦点。结直肠癌组织中，PKM2表达显著增加，且其表达水平与肿瘤浸润深度和临床分期密切相关[18]。PKM2基因沉默能够阻碍细胞增殖和细胞周期，并抑制细胞的克隆形成及迁移能力[18]，重新建立结直肠癌细胞对奥沙利铂(一线化疗药物)的敏感度[19]。目前已发现丁酸、单宁酸等多种药物可以通过抑制PKM2的活性和表达来阻断糖酵解，并进一步抑制结直肠癌细胞增殖和结直肠癌进展[20-21]。因此，PKM2可作为结直肠癌治疗的靶标，抑制肿瘤的发生发展，对结直肠癌患者治疗方式的选择有指导性意义。

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占原发性肝癌的绝大部分，主要通过手术切除和肝移植达到治愈的目的。Li等[22]对GEPIA数据库进行分析发现，PKM2在HCC组织中的表达水平明显高于相邻的正常组织，PKM2高表达患者通常肿瘤较大(P=0.013)、分期较晚(P=0.035)，OS和DFS也明显缩短。PKM2高表达的HCC细胞系通常具有更强的转移潜能[22]，下调PKM2的表达量可直接抑制肿瘤的生长并诱导细胞周期停止和凋亡[23]。此外，原花青素B2和辛伐他汀等药物可以通过下调肿瘤内PKM2表达，有效增强患者对索拉菲尼(晚期一线化疗药物)的敏感度，提高晚期患者的生存率[23-24]。

PKM2在大多数胆囊癌和胰腺癌组织和细胞系中高度表达，可以作为独立的预后因素，协助临床更为全面的判断病情、指导治疗。在胆囊癌早期，PKM2即具有出色的预测价值，在组织中的表达水平随疾病进展逐渐增加，与胆囊癌患者的淋巴结转移、晚期TNM分期和较差的OS、短期复发显著相关，可用于区分高危人群[25]。在胰腺导管腺癌中，PKM2可以与M2型巨噬细胞共同促进肿瘤进展，其表达水平与TNM分期(P=0.0002)和血管侵犯(P=0.012)呈正相关性[26]。PKM2还可作为胰腺导管腺癌的治疗靶点，明显抑制细胞的增殖、迁移[27]。上述研究证实，PKM2在腹腔肿瘤的诊断和治疗方面具有较为广泛的作用。

2.4泌尿生殖系统肿瘤 在女性恶性肿瘤中，宫颈癌的发生率仅次于乳腺癌。目前，临床主要根据宫颈癌患者的FIGO分期决定治疗方案和评估生存预后。FIGO分期主要依赖于妇科检查及活体组织检查，对判断宫旁浸润的主观性及不确定性导致分期偏倚，直接导致治疗方案存在偏差。因此，寻找有效筛查指标，对患者采取相应分层干预治疗非常重要。研究发现，PKM2在宫颈癌患者(尤其HPV阳性患者)的肿瘤组织中转录水平明显增高，其表达水平增加与患者的OS率降低密切相关，具有一定的预后价值[25]。较PKM2低表达患者，PKM2高表达患者对顺铂的化疗敏感度更高，而放射敏感度较弱。监测和靶向PKM2有助于预测和调控宫颈癌患者对顺铂化疗及放射治疗的敏感度[26-27]，弥补FIGO分期的不足。

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其中绝大多数为膀胱尿路上皮癌。研究证实，PKM2在膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用[28]。Huang等[29]对215例膀胱尿路上皮癌患者的肿瘤样本进行检测发现， PKM2在肿瘤组织中过度表达，其中高级别侵入性肿瘤组织尤为明显。PKM2可用于对膀胱癌患者的病情估计和预后判断，其表达水平与肿瘤分级、分期和淋巴结状态显著相关，PKM2低表达患者的OS和DFS均高于高表达者(P<0.01)，死亡风险也更低。膀胱癌细胞中PKM2的下调将抑制细胞增殖，诱导细胞发生凋亡、自噬[30]。同时，顺铂耐药性膀胱癌细胞在经过紫草素、PKM2-shRNA等药物处理后，细胞内PKM2的表达水平下调，顺铂敏感度增加[31-32]。以上研究表明，PKM2相关研究对膀胱癌的诊疗具有实际意义。

肾细胞癌 (renal cell carcinoma, RCC) 是成人肾癌的主要类型，易发生复发和转移，患者的临床结果较差。目前，RCC被认为是一种代谢疾病，因此探索PKM2在其发生发展中的作用可能为RCC提供潜在的治疗策略。现有的研究表明，PKM2在RCC组织及细胞中过度表达，抑制其表达可以有效降低肿瘤细胞活力，并可诱导自噬的发生[33]。PKM2与RCC的关系尚待进一步研究去探明。

2.5血液系统肿瘤 白血病和多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是最常见的两种血液系统恶性肿瘤，分别以造血干细胞或骨髓单克隆浆细胞的恶性克隆为主要特征。PKM2在白血病患者的骨髓细胞及血液中过度表达，调控细胞增殖及分化，并介导几种白血病亚型耐药性(如视黄酸耐药的急性早幼粒细胞白血病细胞)的产生[34]。较PKM2低表达患者，高表达患者的无事件生存率(event free survival ，EFS)及OS显著降低[35]。双氢青蒿素可以通过干扰PKM2的表达抑制白血病细胞增殖，促进细胞分化、凋亡，有效地阻止白血病进展[36]。在MM细胞中敲低PKM2的表达，也有助于抑制MM细胞的增殖和黏附，进而抑制由黏附导致的耐药性[37]。因此， PKM2可能是治疗血液系统肿瘤的潜在靶标。

2.6皮肤及骨肿瘤 皮肤恶性黑色素瘤及骨肉瘤具有恶性程度高、预后差等特点，中晚期患者肿瘤易复发、转移，疗效较差。目前早期筛查指标的相关研究很少，亟需寻找合适的生物标志物。PKM2在黑色素瘤早期阶段的表达水平即明显增加，在骨肉瘤组织中也表达上调，且其表达水平与黑色素瘤及骨肉瘤患者的临床分期、转移和分化情况，以及预后等密切相关[38-39]。通过与病理结果结合，PKM2可用于评估患者的病情及预后。

3 PKM2的临床检测

3.1方法学 酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)是目前医院常用的检测方法之一，利用抗原抗体之间的特异度免疫反应对蛋白进行定性和定量检测。ELISA是一种敏感度高、特异度强、重复性好的实验诊断方法，可用于血液[40-41]、尿液[42]、粪便[43]及宫颈阴道分泌物[44]等多种标本中PKM2的测定。

由于PKM2是一种催化酶，因此酶活性测定法对PKM2的定量更有意义。丙酮酸激酶多为四聚体，对 PEP 具有高亲和力，催化活性较高； PKM2则一般为二聚体，对PEP亲和力低，在变构激活剂果糖1, 6-二磷酸(FBP)激活下可形成四聚体。Guan等[45]运用PKM2的这种特性，设计了乳酸脱氢酶-NADH偶联测定法，使用特异度识别 PKM2 二聚体的单克隆抗体对PKM2进行间接测量。血清PKM2经酶动力学测定法测定对乳腺癌诊断的敏感度为81.0%，特异度为70.0%，与ELISA之间存在很强的相关性(相关系数为0.977)，且准确度相对高于ELISA。

电化学发光免疫分析结合了免疫分析技术和电化学发光反应，通过检测待测物质与发光体标记抗原(抗体)特异度结合后发出的光信号，确定待测物质的含量。与ELISA相比，电化学发光法灵敏度极高，所需血浆体积仅需其他免疫测定方法的50%，测定时间也大幅缩短。Croner等[46]基于电化学发光法对受试者血浆样本进行检测，确立了包括PKM2在内的一组预测因子(敏感度为80%，特异度为83%)，可用于筛查具有结直肠癌高风险的患者。

对于肿瘤活检组织中的PKM2，常使用免疫组化法进行检测，协助对患者的肿瘤分型分期及预后评估，并对患者的治疗方案提出建议。除上述常用方法外，在未经活检的情况下，还可通过生物成像的方式对PKM2进行检测。Wang等[47]通过将PKM2激活剂TEPP-46 与荧光团香豆素结合，设计了一种PKM2 特异度生物探针，可诱导PKM2形成四聚体并发出荧光，通过生物成像高灵敏度检测PKM2。Beinat等[48]则将TEPP-46与PET示踪剂18F DASA-23结合，设计了放射性探针18F DASA-23，通过PET成像的方法判断前列腺癌组织内PKM2的水平，评估肿瘤进展。

3.2临床意义 目前临床上恶性肿瘤早期诊断和筛查多采用血液检测，具有简便快捷、微创性、经济适用等多种优点。血液PKM2与CA19-9、CEA等传统肿瘤标志物联合使用可以有效提高癌症的诊断特异度、敏感度和准确度[40-41]。通过ELISA法检测的血清PKM2对结直肠癌诊断的特异度可达95%，同时还能够区分早期疾病(灵敏度48%)[49]。在用于宫颈癌筛查时，血清PKM2的灵敏度为82%，其表达与宫颈癌患者临床特征(肿瘤直径、TMN分期等)以及病情进展具有显著正相关性[50-51]。此外，血浆PKM2水平同样具有一定的临床诊断价值。苏鹏等[52]研究证实，血浆PKM2可用于反映NSCLC患者疾病状态及预测复发。对NSCLC手术及术后复发患者的血液进行检测发现，血浆PKM2水平在术前较高，术后恢复至正常，患者复发时重新升高。

粪便隐血试验(fecal occult blood test, FOBT)常作为消化道恶性肿瘤的过筛试验在临床上使用。但在实际应用中，FOBT的干扰因素(方法、取材等)较多，准确度和敏感度均不高。粪便PKM2的测定可能是一种有价值的结直肠癌筛查新工具，灵敏度和特异度分别可达73%和78%[43]。在用于结直肠癌的筛查时，免疫化学FOBT特异度和阳性预测值较好(0.89和0.53)，PKM2的敏感度和阴性预测值较高(0.87和0.96)，粪便PKM2检测与FOBT的联合使用有助于预测结直肠癌发生风险[53]。

近年来，尿液检验逐渐被应用于肿瘤发病机制研究和生物标志物筛选等方面，应用范围日趋扩大。在基于尿液的测试中，最常用于诊断和监测膀胱癌的方法是细胞学检查。然而，细胞学检查的敏感度仅为约35%，漏诊比例较高[54]。研究者发现，与正常受试者相比，膀胱癌患者尿液中PKM2水平显著增高，特异度为100%，敏感度可达82%。通过检测尿液PKM2水平可以为临床医生提供快速、有价值的检测，辅助细胞学检查对疑似患有膀胱癌的患者进行筛查[42]。

阴道和宫颈分泌物主要由子宫内膜和宫颈腺体产生。在子宫内膜或宫颈发生病变时，病变细胞表面脱落的一些可溶性蛋白成分可能直接进入分泌液中。因此，宫颈、阴道分泌物可用于检测某些肿瘤标志物。蔡尚霞等[44]对156例子宫内膜病变患者的宫颈及阴道分泌物中的PKM2进行检测发现，与正常受试者相比，患者分泌物中PKM2水平明显增加，与血清PKM2的联合使用可用于区分子宫颈及子宫内膜的增生和癌变，有利于早期筛查和诊断。

4 小结与展望

PKM2过表达于头颈部、胸部、腹腔等多部位肿瘤组织中，在肿瘤细胞的增殖分化、侵袭和迁移中发挥重要的作用，与患者较差的临床表现和不良预后密切相关。临床上对病变组织的活检标本进行PKM2检测，有助于进一步明确诊断、指导分期分型及治疗方案、评估预后等。利用ELISA等常规实验技术对体液和粪便等标本中PKM2的存在及水平进行检测，对结直肠癌、NSCLC、宫颈癌等癌症诊断的敏感度和特异度不逊于传统肿瘤标志物，有利于肿瘤的筛查、诊断和术后监测等，是一种潜在的肿瘤检测手段。此外，PKM2也可作为肿瘤的治疗靶点，通过抑制肿瘤的增殖及侵袭能力或调控患者对放疗、化疗的敏感度诱导肿瘤细胞的死亡。