转录组测序在新城疫病毒感染中的应用与研究进展

贾燕青，仇薪鑫，佛香霖，杨增岐

(1.杨凌职业技术学院动物工程分院/动物疫病防控陕西省高校工程研究中心，陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

新城疫(Newcastle disease,ND)又称伪鸡瘟，是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒株引起的一种急性、高度接触性传染病，临床症状常以高热、呼吸困难、黏膜及浆膜出血、下痢、神经紊乱等为典型特征[1-2]。新城疫发病时，传染性强，传播极快，发病率和致死率较高，能够引起鸡和多种鸟类发病，据统计，新城疫能够侵害鸡、水禽、野生禽类等250多种不同宿主，给养禽业造成了严重的经济损失[3-5]。NDV虽然只有一个血清型，但其基因型多、变异快、传统疫苗免疫易失败等原因，使得现有疫苗防控NDV感染效果不理想，因此，迫切需要探索防控该病的新策略[4-7]。据报道，基因转录在病毒感染宿主的过程中发挥着重要的调控作用[8-11]，研究NDV感染后基因表达谱，有利于阐明NDV感染与宿主之间的相互作用，为筛选新城疫防控靶点和方法提供新的思路和策略。

转录组(transcriptome)是指组织或细胞在某一特定的发育阶段或生理条件下，细胞内所有转录本及其数量的集合[2,5]。通过转录组学研究，可以实现对基因的多方面研究。第一，对所有物种的转录本进行分类研究，这些研究包含mRNA、微小RNA(microRNA,miRNA)及非编码RNA；第二，可以确定基因的转录结构，包括基因的起始位点(5′和3′末端)、剪切模式以及基因转录后的修饰等结构；第三，可对不同条件下的每种转录本表达水平的变化进行量化统计，用于基因表达的比较等研究中[2,5,12-13]。

目前已开发多种用于转录组研究的技术和方法。以杂交为基础的基因芯片技术，该方法相对便宜，但存在对基因组依赖性强、杂交背景高、测序通量低及操作复杂等限制，如寡聚核苷酸芯片、cDNA芯片等[14]。测序技术的快速发展，以其为基础的方法可直接完成cDNA序列的确定，早期以Sanger测序为基础的cDNA或表达序列标签(expressed sequence tag，EST)文库，虽然可以实现测序通量高且基因表达水平数码化，但是测序成本高、背景高、检测范围窄且不能有效区分相似序列，如大规模平行信号测序系统、全长cDNA文库及基因表达系列分析等[2,14]。随着分子生物学的发展，新型高通量DNA测序方法的快速发展为映射和定量分析转录组提供了新的支撑和平台。转录组测序(RNA sequencing，RNA-Seq)是利用深度测序技术进行转录组分析的一种新技术[2]。RNA-Seq是基于深度测序技术，将总RNA转化成一个在单端或两端具有接头的cDNA文库，再对每个片段进行高通量测序，从单端或双端测序获取较短的序列(即reads)。不同的DNA测序方式获得的reads长度有所不同，通常为30 bp～400 bp。测序完成后，对所得的reads既可与已有的参考基因组及参考转录本进行比对，也可在无参考基因序列时，进行重新组装来获得由基因转录结构和表达水平组成的基因转录图谱[15-16]。

因此，基于RNA-Seq技术的转录组测序可以对NDV感染后宿主与病毒间的相互作用进行研究，有利于阐明病毒感染时宿主机体基因表达的变化、关键基因的筛选及基因间的调控，是研究揭示NDV感染时复杂的生物过程和解释转录水平调控网络的重要方法。

1 转录组测序优势

与其他测序技术相比，除了经济、方便、快捷等优势外，RNA-Seq主要有以下几个优势：(1)对转录本的检测没有限制，即可对没有参考基因组序列的物种实现直接转录组测序及分析，如癌症干细胞或珍惜野生动物等，这使得RNA-Seq可参与对未知序列或来源少的非模式组织进行检测[14]；(2)灵敏度高，RNA-Seq可达到一个拷贝数，且能区分单碱基差异，可揭示在转录区域的序列变异，如单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析，更真实地了解和评价细胞中全部基因的表达，对获得的小片段可提供2个外显子间联系的信息，长片段或两端测序可以揭示多个外显子间的联系，这种方法可用于比较复杂的基因转录组的研究中[17]；(3)精确度高，RNA-Seq背景信号通常较低，DNA序列可以直接匹配到基因组的特定区域[14]；(4)检测力强且重复性高，一次可产生几百万的数据量，几乎涵盖细胞中所有表达的基因，能够最大限度地检测到一些丰度低的稀有基因的转录本，还可以鉴定和量化正常基因转录本和稀有基因转录本，是发现新基因的一种新的方法和途径[2]。

通过RNA-Seq，可以高通量地获得基因表达时mRNA的相关信息，也可对特定的细胞或组织中的基因表达进行检测，实现对基因表达变化、样品间基因表达差异、未知基因转录本、基因特殊转录本以及稀有转录本等的分析研究，从基因表达层面解释基因与一些生命现象之间的关联，为病毒与宿主间的免疫反应或抗病育种等研究提供新的思路和依据。基于RNA-Seq的各种优势，该技术已广泛应用于基础科学研究、生物标记技术、动物疾病机理、药物研发及动物抗病育种等领域研究中，目前也有多篇利用该技术进行转录谱分析的论文发表[15-16,18-20]。

2 转录组测序技术在新城疫病毒感染中的研究

2.1 基因表达模式研究

病毒在感染宿主过程中，与宿主互作的本质和复杂性等大部分内容都可以通过宿主基因转录变化谱来了解，这样就可以筛选到与病毒复制等过程相关的关键候选基因。转录组测序技术虽在多种病毒研究中应用广泛，但在NDV感染中仅有少量转录组相关报道，这些在NDV感染后的组织或细胞上转录组研究给人们提供了很多有用的信息。例如，Liu W等[13]利用RNA-Seq方法对NDV强毒株(Herts/33)及弱毒株(La Sota)感染的鸡源原代成纤维细胞(chicken embryonic fibroblasts,CEFs)进行测序，共得到8 433个差异表达基因，其中获得与干扰素刺激基因(interferon-stimulated gene，ISG)相关的基因有3 616个，这些基因的筛选为深入研究NDV感染与宿主抗病毒之间的关系奠定了基础。Wang XW等[21]基于RNA-Seq技术，比较了NDV强毒株F48E9感染48 h和72 h后的转录谱，共检测到1 498个差异表达基因 (differentially expressed gene,DEG)，根据基因本体论(Gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集分析，这些DEGs主要与先天免疫、炎症反应以及物质代谢相关的信号通路有关，提示NDV 强毒株引起的过度炎症和先天免疫反应可能与严重的法氏囊损伤有关。Zhang J等[22]对21日龄的蛋鸡进行NDV感染后2 d和6 d的脾脏进行转录组测序发现，在感染2 d时有526个DEGs，而在 6 d时仅鉴定出36个DEGs，这些基因参与调解免疫细胞发育、神经发生和血管生成等通路，其中软脂酰化磷蛋白(Sprouty1,SPRY1)基因在同群感染NDV毒株6 d时表现出与病毒载量的重要相关性，这些研究为增强鸡NDV抗性育种奠定了基础。Guo LX等[23]对NDV感染96 h内的鸡胸腺组织进行转录组测序研究，发现24 h有1386个DEGs，其中表达上调基因有989个和表达下调基因397个，48 h有728个DEGs，其中567个上调基因和161个下调基因，72 h的1514 DEGs分别有1 016个上调和498个下调基因，96 h的1 196个DEGs 分别有522个上调和674个下调基因，这些DEGs在细胞成分、生物过程和物质代谢过程中大量富集，这可能与NDV的致病性有关，为深入了解病毒-宿主相互作用的复杂调控机制提供了数据支撑。利用RNA-Seq技术对东南亚流行毒株NDV-GVII感染的脾脏进行转录组测序发现，与对照相比，有3 506个基因上调和2 855个基因下调，差异表达基因的功能分析显示，在脾脏中ElF2信号传导、mTOR信号传导、淋巴系统细胞增殖、Rho家族 GTP酶信号传导等调节发生改变，这项研究为新出现的 NDV-GVI在激活自噬介导的细胞死亡、嗜淋巴细胞和突触发生信号通路方面的分子发病机制提供了新的见解[24]。通过转录组测序发现，在NDV感染的细胞外泌体中有7个免疫反应相关的基因表达上调，并发现NDV可以通过外泌体输出核苷酸结合寡聚结构域样受体家族成员X1(NOD-like receptor family member X1,NLRX1)mRNA，从而减弱细胞抗病毒能力来帮助病毒在细胞内的增殖[25]。

2.2 非编码RNA调控机制研究

非编码RNA虽然不能直接产生蛋白质，但是对基因表达起着关键作用，近年来发现这些基因在动物育种、疾病防控及生产性能改良等方面越来越受重视[26-29]。为了鉴定miRNA表达与NDV复制过程的关系，Chen Y等[26]利用RNA-Seq获得了NDV分离株JS5/05感染DF-1细胞6 h和12 h后的miRNAs表达谱，与对照组相比，感染6 h和12 h分别有73个和64个miRNAs表达差异显著，深入研究发现gga-miR-451可靶向酪氨酸3单加氧酶/色氨酸5单加氧酶激活蛋白ζ(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein zeta,YWHAZ)基因抑制NDV诱导的炎症反应。Chen Y等[30]为阐明NDV在肿瘤细胞中miRNA的变化和调控机理，对感染NDV 6 h和12 h后的Hela细胞进行测序分析，发现NDV可以明显提高3个miRNAs并抑制了20个miRNAs的表达水平，这些miRNAs可靶向参与病毒复制和抗病毒免疫的多个基因，为进一步研究miRNAs在NDV介导的溶瘤作用提供有价值的基础。在NDV La Sota疫苗注射后24、48、72和96 h后，通过RNA-Seq技术对胸腺组织中的circRNA、miRNA和mRNA表达进行分析发现，与高表达的gga-miR-6631-5p相关的天然免疫有关的差异表达基因共有7个，为研究疫苗毒株在鸡群中的分子反应提供了全面的信息[31]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是长度超过200个核苷酸的转录本，可参与多种生物活动的调节，利用转录组测序分析NDV感染后的鸡哈德氏腺体，筛选了359个差异表达lncRNAs，鉴定了1232个与lncRNAs有互作的相关基因的数量性状基因座，并确定了lncRNAs推定miRNAs前体的作用，这些研究揭示了lncRNAs在宿主对NDV感染反应中的作用，也为易感鸡群品种遗传改良调控提供了有力的数据支撑[32]。

3 展望

虽然目前在转录组水平对NDV感染机理研究中已经取得了一定的研究进展，但是对NDV与宿主之间的相互作用依然不清晰，主要是当前的研究过多关注NDV感染后宿主基因表达量的变化，对病毒基因转录的研究还依然欠缺；对疫苗毒株La Sota和经典强毒株F48E9研究过多，而NDV的基因型比较多，不同基因型的NDV对宿主的致病性存在差异，宿主对不同毒株的反应也存在差异，缺乏系统研究不同NDV毒株与宿主基因转录间的关系；缺乏对筛选的差异表达基因深入研究，没有深入阐明NDV感染后宿主产生的免疫应答关键环节。随着当前测序技术的快速发展，基于三代测序技术的应用已为转录组学研究提供了新的平台[33-35]，也为深入研究NDV的致病性及宿主免疫应答提供了有利的工具。因此，利用新的测序技术研究不同基因型NDV的感染机制，可以更系统、深入地揭示NDV感染期间病毒与宿主基因表达的变化，为新城疫防控、疫苗研发及靶向药物开发提供了有利的支持。