阳离子脂质体体外转染实验条件的优化研究

2022-11-24李洪梅姜恩平裴轶劲孙艳芹尹金宝

当代医药论丛 2022年13期

李洪梅，姜恩平，裴轶劲，孙艳芹，尹金宝

（广东医科大学1. 病理学系2. 生理学教研室，广东东莞 523808）

阳离子脂质体是被公认的有研发前景的基因传递载体。其结构可分为三部分，即带正电荷的阳离子头部、连接键和疏水尾部[1]，其介导核酸（本文以质粒DNA 为例）进入细胞的过程主要分为以下三步：1）阳离子脂质体带正电荷的头部与带负电荷的质粒DNA 通过静电作用结合，形成脂质体-DNA 复合物[2]。其中质粒DNA 因被包裹在复合物内部而受到保护，其所带负电荷被屏蔽，而阳离子分布在复合物表面，故所形成的复合物表面带正电荷[3]。2）表面带正电荷的阳离子脂质体-DNA 复合物通过静电作用吸附于表面带负电荷的细胞膜表面[3]，继之复合物被内吞进入细胞质内。随后DNA 被释放至细胞质内[4]。3）极少一部分被释放的DNA 可进入细胞核，得以转录表达[4-5]。基于上述阳离子脂质体介导核酸进入细胞的过程，本文从六个方面对某些学者及笔者自身优化转染条件的经验加以总结。

1 靶细胞的类型、状态及密度

靶细胞的类型不同，应用同种转染方法进行转染的效率也会有所不同[4]。转染贴壁细胞时，细胞应处于单层、生长旺盛的对数生长期。细胞传代次数不宜过多，一般复苏后传至第2 或第3代即应进行转染；复苏但尚未传代的细胞，一般不应使用，转染效率会很低。另外，转染时细胞的融合度一般以60% ～85% 为宜。

2 阳离子脂质体与核酸的比例

为提高转染效率，阳离子脂质体与核酸的比例应尽可能符合最佳电荷比[6-7]。阳离子脂质体与质粒DNA 的电荷比越高，毒性越强[8]。若质粒DNA 的用量过多，将造成阳离子脂质体结构不稳定，或质粒DNA 在所形成的脂质体-DNA 复合物中不能很好地被包裹和保护，或产生过强的毒性，从而导致转染效率低下[5,9]；在阳离子脂质体的浓度超过一定范围后，浓度越高，毒性也将越强，转染效率也将大幅度下降。

3 核酸的纯度

盐离子、蛋白、多糖和内毒素存在于质粒DNA 溶液中均会影响脂质体-DNA 复合物的形成效率，并会带给细胞较强的毒性，进而影响转染效率，降低细胞存活率[10]。故制备质粒时，应尽可能提高纯度。

4 时间

若想确保转染成功，需要注意优化以下时间：1）阳离子脂质体- 质粒DNA 复合物形成时间。若上述形成时间过短，将影响转染效率[8]。2）转染时的孵育时间。在一定的时间范围内，转染效率会随孵育时间的延长而升高。若孵育时间过短，脂质体-DNA 复合物尚未充分通过细胞膜，转染效率将会很低；若孵育时间过长，脂质体、质粒DNA 或其中所混有的某些物质就会对细胞造成毒性，从而影响转染效率。3）检测转染是否成功的时间。若检测时间过早，转染的核酸可能尚未表达或表达量过小（进入胞浆中的质粒DNA，其仅约有1/1000 的几率能进入细胞核[5]）。