Caspase家族参与乳牙根吸收牙髓组织细胞凋亡的研究进展

林珊如，钱 虹，吕婧雯，萧曼雪

与恒牙牙根的病理性根外吸收和内吸收相比，生理性根吸收是乳牙牙根特有的正常的生理现象[1]，其为继承恒牙的萌出预留出足够的空间，避免了恒牙的异位萌出，这一过程对于继承恒牙的萌出至关重要[2]。在乳牙牙根生理性吸收过程中，牙髓组织的减少与细胞程序性死亡，即细胞凋亡密切相关。天冬氨酸特异性蛋白水解酶(cysteine-containing aspartate-specific protease，Caspase)是一种促使细胞凋亡的蛋白酶，在细胞凋亡机制网络中处于核心地位[3-4]。本文就乳牙生理性根吸收过程中牙髓组织的细胞凋亡及Caspase家族在其中发挥作用的研究现状作一综述。

1 乳牙根吸收过程中牙髓组织发生细胞凋亡

牙髓位于髓腔和根管内，是一种富含血管的疏松结缔组织，内含大量长梭形的成纤维细胞、纤维及血管，在近牙本质侧有呈栅栏状排列的成牙本质细胞[5-6]。研究发现，在根吸收早期，牙髓中细胞的排列及数目正常，成牙本质细胞层连续。随着根吸收的进行，根尖部近根吸收区域出现破牙细胞，成牙本质细胞层开始不连续，部分成牙本质细胞被日渐活跃的破牙细胞替代[7-9]。随着乳牙生理性根吸收的进行，牙髓中细胞的数目逐步减少。在牙根吸收完成时，牙髓组织基本失去了原有的组成和结构，主要表现在成牙本质细胞减少、碎片状的细胞增加等[10-11]。

为进一步了解生理性根吸收过程中牙髓中细胞减少的机制，Bardellini等拔除处于生理性根吸收晚期阶段的乳牙后即刻取出牙髓，固定后制作组织石蜡切片，苏木精-伊红染色,观察到与恒牙牙髓相比，乳牙牙髓中大量细胞体积缩小，与周围细胞脱离，细胞周围出现清晰的白晕，胞质和胞核皱缩，呈现典型凋亡细胞的形态[12-13]。细胞凋亡被广泛认为是一种动态的非炎症过程，它不会引起免疫系统反应[14]，在组织学水平上，凋亡小体的存在表明牙髓在生理性根吸收过程中有细胞凋亡现象。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位缺口末端标记法 (TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)和DNA琼脂糖凝胶电泳为常规检测细胞凋亡的方法[15]。Rodrigues等[16]应用TUNEL法检测牙髓细胞DNA片段显示，乳牙牙髓中出现大量广泛分布的深染细胞，这是基于凋亡细胞核与反应底物二氨基联苯胺发生过氧化物酶反应，使得细胞呈暗褐色[17]。实验的对照组为因正畸需求而拔除的健康前磨牙，在此组中阳性标记的细胞分布较为稀疏。乳牙组与恒牙组分别计数凋亡细胞，计算凋亡指数，统计学分析结果显示乳牙牙髓细胞的凋亡指数显著高于恒牙。除TUNEL法检测细胞凋亡外，DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示，在乳牙牙髓中观察到大量DNA核小体碎裂条带，而在恒牙中，大部分DNA仍然处于未破碎状态。上述研究均提示乳牙生理性根吸收过程中牙髓组织中细胞数目及形态的变化与细胞凋亡相关。

2 Caspase家族与细胞凋亡

细胞凋亡这一术语在1972年由Kerr等[18]在一篇论文中首次使用。它是指在接收到外部或内部信号后，机体内细胞主动争取死亡的过程，其目的是为了更好地适应当前所处的环境[3]。如前文所述，乳牙的生理性根吸收是为给继承恒牙的萌出预留出足够的空间。细胞凋亡涉及一系列相关基因的陆续激活，相应mRNA的表达以及调控基因的相互作用等。

细胞凋亡的诱导与执行需要一系列蛋白分子信号共同作用，如信号分子、受体、蛋白酶等，其通路复杂，途径多样[19]。目前，对于乳牙生理性根吸收过程中牙髓细胞凋亡的文献报道主要集中于Caspase家族和对Caspase家族起调控作用的B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族[12-13,16,20]。目前将在细胞凋亡中发挥作用的Caspase分为两类：一类是起始者，主要有Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10；另一类是执行者，主要为Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7[21-22]。

依据现有的研究结果，目前普遍认为Caspase前体的活化主要通过以下三种路径：①死亡受体途径，即外源性途径(Caspase-8/10依赖途径)；②细胞色素c(cytochrome-c, cyt-c)诱导的线粒体途径，即内源性途径(Caspase-9依赖途径)；③穿孔素/颗粒酶途径[19,23]。这三种途径均通过活化上游的Caspase酶原起始蛋白，激活执行蛋白Caspase-3，最终实现细胞凋亡。此外，在线粒体途径中，Bcl-2家族作为调控者，在Caspase的活化及级联反应中起着调控作用[24]。Bcl-2家族中有着众多的基因，其中与细胞凋亡相关的基因主要有抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bcl-2相关X基因(Bcl-2 associated X,Bax)。Bcl-2蛋白和Bax蛋白二者构成二聚体结构，调节控制细胞凋亡的进程[25]。

基于细胞凋亡通路的多样化，不断有学者进行深入研究，试图理清乳牙生理性根吸收过程牙髓中细胞以何种方式发生凋亡，进一步了解其凋亡机制，为后续研究及临床应用奠定基础。

3 Caspase家族在乳牙生理性根吸收牙髓组织细胞凋亡中的研究

目前对Caspase家族作用范围及作用机制的研究广泛[26]，而在牙髓中细胞凋亡方面，主要集中于两种凋亡途径，分别为死亡受体途径和线粒体途径，所研究的Caspase家族成员主要为Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9,以及在线粒体途径中起调控作用的Bcl-2和Bax。

3.1 Caspase-3

在乳牙生理性根吸收与细胞凋亡机制的研究中，均检测到了Caspase-3在乳牙中的活跃存在。Rodrigues等[12]收集恒牙和处于根吸收晚期的乳牙，提取其牙髓组织中总RNA进行免疫荧光PCR以及牙齿脱钙后切片行免疫组化染色，对Caspase-3在mRNA水平和蛋白质表达水平进行定性定量分析，发现Caspase-3在乳牙牙髓中表达强阳性且表达量显著高于恒牙。此外，有研究分离培养乳、恒牙牙髓干细胞，采用实时荧光定量PCR和免疫印迹试验检测Caspase-3的表达，结果亦显示Caspase-3在乳牙牙髓干细胞中的转录水平高于恒牙[20]。Bardellini等[13]着眼于牙髓中的成牙本质细胞，通过苏木精-伊红染色及免疫组化染色，观察到乳牙牙髓中成牙本质细胞数目较恒牙明显减少，乳牙成牙本质细胞层中Caspase-3活跃表达。

作为Caspase家族中细胞凋亡的执行者，无活性的Caspase-3酶原在接受上级凋亡刺激后被活化，切割其作用底物，Caspase-3对底物作用引起的变化包括：①终止细胞周期继续进行；②使得细胞与周围非凋亡状态的正常组织剥离；③打破细胞新旧更替的平衡，并使细胞无法对此进行修复；④破坏细胞间的连接[27-28]。

3.2 Caspase-9与Bcl-2家族

有学者研究发现，Caspase-9在乳牙牙髓干细胞中的转录水平高于恒牙,转染Caspase-9 siRNA使Caspase-9基因沉默后，Caspase-3的表达显著降低，Caspase-9的上游调控基因的表达在转染组与未转染组间无显著差异[20]。因而学者认为，Caspase-9与乳牙牙髓干细胞的凋亡有关，乳牙牙髓干细胞的凋亡可能是通过线粒体途径进行的。Bardellini等[13]对成牙本质细胞的研究也发现，对Caspase-9起调控作用的促凋亡基因Bax在乳牙成牙本质细胞中表达较抑凋亡基因Bcl-2多。这一结果也佐证了乳牙牙髓干细胞凋亡与Caspase-9，即与线粒体途径的相关性。

线粒体途径是由终末分化、生长因子缺乏、DNA损伤等刺激激发的。在乳牙生理性根吸收过程中，接受到凋亡信号后，这些因素克服了抗凋亡因子的抑制作用，激活了一个或多个促凋亡因子。线粒体膜的通透性提高，使得cyt-c能从线粒体释放到细胞质中[29]。被释放到细胞质后，cyt-c和凋亡酶激活因子-1(apoptosis protease activating factor-1,Apaf-1)以及脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate，dATP)相结合。Apaf-1在凋亡小体中处于中心的角色，它的作用是招募并且活化Caspase-9。在没有凋亡信号刺激的情况下，apaf-1以单分子的形式存在。然而，当遇到cyt-c和dATP时，Apaf能与这二者特异性结合，形成一个轮状的信号平台，即凋亡小体，从而激活Caspase-9[24]。Caspase-9酶原被活化后，激活位于下游的执行者Caspase-3，从而执行细胞凋亡。此外，被活化的Caspase-3又能进一步活化Caspase-9酶原，从而形成一种正反馈调节，加速细胞凋亡的进程[27]。在此途径中，Bcl-2及Bax作为一对调控基因，可促进或抑制Caspase-3酶原的活化[30]。

3.3 Caspase-8

目前对于Caspase-8在乳牙与恒牙牙髓中表达的多寡尚存争议。在Rodrigues等[12]的研究中Caspase-8在乳牙和恒牙中均呈低水平表达。然而有研究发现Caspase-8在乳牙牙髓干细胞中mRNA水平高于恒牙，但Caspase-8沉默组与对照组间Caspase-3的表达未见明显差异[20]。这一结果否定了Caspase-8介导的死亡受体途径与乳牙牙髓组织细胞凋亡的关系。牙髓干细胞的体外研究不能完全模拟体内微环境，且现有研究水平数量及深度尚不足，因此，死亡受体途径是否参与了乳牙根吸收过程中牙髓组织细胞的凋亡仍有待商榷。

4 总结与展望

当前研究表明，细胞凋亡在乳牙生理性根吸收时期牙髓细胞的清除过程中占据重要地位，且很有可能是通过内源性途径，即cyt-c诱导的线粒体调节途径实现的。目前对于乳牙生理性根吸收过程中细胞凋亡的研究较少，研究对象多是牙髓中的所有细胞。而牙髓组织中细胞种类丰富，目前仅针对整体或极个别种类细胞，如牙髓干细胞、成牙本质细胞进行研究，所得实验结果不具有代表性，并不能表明牙髓组织中所有细胞均通过同一凋亡路径实现凋亡，目前仍未明确是否存在其他凋亡通路。

现有研究表明咀嚼压力、继承恒牙胚压力、遗传因素等均会导致乳牙生理性根吸收[31]，也就是说，在没有继承恒牙的情况下乳牙仍有可能会发生生理性根吸收，脱落后将导致牙列缺损。牙齿发育异常的患病率为(6.53±3.33)%，先天缺牙将对儿童的颌面部发育及咀嚼功能产生影响[32]，而儿童处于生长发育期，种植修复的时机及预后不明确[33]，理清乳牙生理性根吸收过程中的凋亡机制，或许能为相关研究提供理论基础，从而为错牙合畸形的预防提供思路。