牙龈间充质干细胞递送支架载体的研究进展
2022-11-24王法程郝鹏杰卢志山
王法程,郝鹏杰,卢志山
牙龈间充质干细胞(gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)是存在于人类牙龈间充质组织中未分化的细胞,具有自我更新、多向分化和免疫调节的能力[1];在促进骨、肌肉、神经和牙周组织的再生,促进伤口愈合,治疗口腔肿瘤、唾液腺疾病、种植体周围炎等方面具有巨大的应用潜力[2]。牙龈组织在临床上容易获取,GMSCs来源广泛,并且其具有诸多优良特性,因此GMSCs是一种较为理想的种子细胞。
组织工程技术包括种子细胞、支架材料和生长因子三个方面,将干细胞悬液接种于支架材料并植入组织缺损处是组织工程的常用方法[3]。支架载体不仅可提供细胞机械支撑、保护细胞免受体内有害微环境的影响,还可以促进细胞的存活、增殖和分化[4]。本文就牙龈间充质干细胞组织再生中,维系GMSCs活性的细胞递送支架载体的研究进展作一综述。
1 天然高分子材料(natural polymers)
天然高分子材料是动、植物体内天然存在的大分子材料,是最早使用的支架材料,因具有良好的生物相容性而被广泛应用,其有利于间充质干细胞的粘附、分化和增殖,常用于组织工程的天然高分子材料主要有:藻酸盐、胶原、壳聚糖等[5]。
1.1 藻酸盐类
藻酸盐是从褐色海藻中提取的天然多糖,具有良好的生物相容性、凝胶性和交联性,长期以来都被认为是一种优秀的植入材料[6]。Moshaverinia等[7]制备了可注射、可降解的海藻酸钠微球递送载体,结果表明,海藻酸钠作为牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)和牙龈间充质干细胞细胞递送支架是一种很有前途的候选材料,具有将PDLSCs和GMSCs定向分化为骨组织和脂肪组织的能力,证明了海藻酸钠微球可作为PDLSCs和GMSCs的细胞递送载体,为骨组织工程提供了一种有前途的策略。
然而,由于海藻酸钠的生物惰性使其在体内降解困难,限制了细胞的粘附、延伸和迁移。因此,有研究将海藻酸盐进行化学修饰,来增强包封干细胞的活性,增加其降解率以增强干细胞的增殖和粘附,或将信号分子递送到封装在支架中的干细胞内。有研究表明[8],封入RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽)偶联藻酸盐微球支架的GMSCs对免疫缺陷小鼠的颅骨缺损具有修复作用,以TGF-β1为载体的新型RGD偶联海藻酸钠微球支架能够影响GMSCs的活性,诱导其向软骨细胞分化,且TGF-β1在海藻酸钠微球中具有缓释作用。Diniz等[9]还利用一定浓度的乳酸银能够对钛表面的伴放线放线杆菌产生抗菌活性的特点,制备了一种含有乳酸银(silver lactate,SL)的RGD偶联海藻酸盐水凝胶支架作为具有抗菌特性的干细胞递送载体,体外实验证明了该GMSCs细胞递送载体对治疗种植体周围炎的作用,其不仅拥有乳酸银的抗菌特性,还具有GMSCs成骨特性,为未来治疗种植体周围炎和骨组织工程技术提供了新的思路和方法。随后,Ansari等[10]改进了GMSCs细胞递送载体,制备了基于海藻酸钠和明胶甲基丙烯酸(gelatin methacryloyl,GelMA)的水凝胶制剂,将GMSCs封装在水凝胶制剂中,结果表明与单纯海藻酸钠支架材料相比,在海藻酸钠-GelMA水凝胶中,GMSCs的存活率显著提高且在两周后GMSCs仍然表达CD146,从而获得更好的组织再生。研究表明,海藻酸盐的降解程度受其氧化程度和周围介质的影响。因此,未来可通过对其不断的修饰,改进GMSCs细胞递送载体的性能,来提升GMSCs的成活率和组织再生的成功率[11]。
GMSCs不仅具有成骨定向分化功能,还具有肌肉组织、神经组织分化功能,海藻酸钠类支架能够将GMSCs种子细胞包封,使其粘附、增殖和分化。Ansari等[12]制备了一种可注射的具有多种生长因子释放能力的三维RGD偶联藻酸盐支架,用于包封GMSCs,并将微囊化的GMSCs皮下移植到小鼠体内,结果表明GMSCs表现出肌细胞样形态且有肌肉再生相关基因标记的高水平mRNA表达,而且在小鼠皮下也能检测出肌肉组织再生,证实RGD修饰的海藻酸钠水凝胶包裹的GMSCs体系具有多种生长因子的释放能力,是一种很有前途的肌肉组织工程候选材料。此外,修复或再生受损的神经目前仍然是一个具有挑战性的临床难点。Ansari等[13]以海藻酸钠和透明质酸水凝胶为基础,制备了海藻酸钠/透明质酸水凝胶三维细胞递送载体;在基质和适合信号分子的调控下,包裹在细胞递送载体中的GMSCs能够向神经源性组织增殖和分化。
1.2 胶原
胶原(collagen,Co)在自然界中主要存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型5种,骨组织工程中常用的为Ⅰ型胶原,其主要功能就是连接组织和器官,胶原亲水性较好,对细胞的生长能够起到很好的诱导作用。胶原作为胞外基质的主要组成成分,不仅可为干细胞提供附着支架,且具有无毒、生物相容性好的特点,同时还是细胞信息载体,可与细胞之间进行分子信号传递。Wang等[14]将增强型绿色荧光蛋白标记的GMSCs种植在Ⅰ型胶原凝胶支架上,将其植入到SD大鼠下颌骨缺损和颅骨缺损处,结果表明实验组成骨相关基因表达更高,组织形态学分析和荧光显微镜图像分析也证实缺损区的新骨形成来源于移植的GMSCs。
然而,由于胶原缺乏一定的机械强度,导致其在一定外力作用下无法为其内的干细胞保障适当的生存空间。因此,今后在胶原的力学性能或者胶原与其他支架材料复合等方面需进一步的研究。为了解决胶原作为支架的这一缺点,目前已有商品化的三维胶原支架,比如BioRipar(BioR)牛心包胶原膜、MatriDerm®生物相容性支架。BioRipar(BioR)牛心包胶原膜是一种新型三维胶原支架,有研究将GMSCs接种到BioR上,并使用抗坏血酸(ascorbic acid,AS)处理,结果表明GMSCs在BioR胶原支架的体外环境中,补充AS能够增强GMSCs的成骨分化能力,并且骨特异性标记物的表达明显上调[15]。MatriDerm®是一种含有胶原蛋白的三维生物相容性支架,具有生物材料的自然特征和特性,Cristaldi等[16]研究表明,GMSCs能够在Matriderm®胶原支架中生长、均匀分布,并且成骨分化能力得到提高,Matriderm®胶原支架可用于开发较低成本和无痛的口腔自体骨组织再生的临床治疗策略。
1.3 壳聚糖(chitosan,CS)
壳聚糖又称脱乙酰甲壳素,壳聚糖无毒、无刺激,生物安全性优良,有一定的抗菌性,是一种带正电荷、高电荷密度的碱性多糖;其植入体内后,在生理pH条件下聚合物可部分解离,这使得壳聚糖可作为带负电荷的生物活性物质的控释载体[17]。壳聚糖本身降解速率较缓慢,且无法调节,加工性能差,单独使用不能满足作为支架材料的要求,这限制了单一壳聚糖作为组织工程生物支架的使用。但是,壳聚糖骨架上含有大量的羟基和氨基,非常适合对其进行改性来制作出具有优越性能的壳聚糖复合支架材料。因此,有学者合成了不同壳聚糖含量的高性能3D-明胶-壳聚糖复合水凝胶,将人骨髓间充质干细胞接种于此复合水凝胶中,并在人血小板裂解物(human platelet lysate,hPL)存在的情况下评估干细胞的增殖和成骨分化能力,结果表明,明胶-壳聚糖复合水凝胶作为干细胞递送载体与hPL结合应用能够促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化[18]。Shi等[19]成功分离出GMSCs外泌体,采用冷冻干燥法制备了壳聚糖/蚕丝水凝胶海绵,并将其作为GMSCs外泌体的细胞递送支架载体材料,促进了糖尿病大鼠皮肤创面细胞外基质再上皮化,促进了血管生成和神经元的生长。这一发现不仅有助于探索GMSCs来源的外泌体在伤口愈合中的作用,而且为GMSCs来源的外泌体在非侵入性皮肤组织修复中的应用提供了一种新的思路和方法。
2 人工合成材料(synthetic polymers)
人工合成材料主要包括人工合成的有机高分子聚合物、无机材料等,其优势在于可通过调整材料的分子量、组成比例及组分,来满足不同的组织工程对细胞支架的需求。
2.1 聚乳酸(polylactic acid,PLA)
聚乳酸是一种人工合成的单体,具有良好的机械强度和热塑性,它还是一种可生物降解性材料,其降解产物为乳酸,无细胞毒性。Diomede等[20]通过富含GMSCs和条件培养基(conditioned medium,CM)的3D-聚乳酸(3D-PLA)支架探讨了其成骨能力和大鼠颅骨缺损再生的能力,结果显示成骨相关基因表达上调,GMSCs在3D-PLA载体支架中具有良好的成骨能力。骨组织再生过程需要提供成骨和血管生成微环境以促进成骨生长,近年来富含GMSCs和/或其衍生物胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的3D生物材料也取得了良好的效果。Pizzicannella等[21]将GMSCs/EVs包封到3D-PLA支架材料中,结果显示成骨和血管生成标记物RUNX2、VEGFA、OPN和COL1A1的表达均增加,并且,植入3D-PLA/hGMSCs/EVs的大鼠组织学检查也证实了骨再生和血管化过程的激活。EVs携有蛋白质、mRNA和microRNA,并可转移到靶细胞中,这可能与缺损部位骨再生和血管形成能力增强相关。因此,将EVs与3D-PLA合成复合支架材料,能够为骨组织再生的血管形成提供新的策略。通过改进生物支架材料的方法,促进骨组织再生和血管化形成,是骨组织再生医学的重要研究方向。
2.2 聚己内酯(polycaprolactone,PCL)
聚己内酯是美国食品和药物管理局(FDA)普遍认为安全的一种合成聚合物。它具有良好的生物相容性,在体内完全降解为CO2和H2O,已经被批准应用于药物输送和医疗器械,研究者们也已将PCL微球用于控释给药系统和组织工程支架中[22]。Jauregui等[23]使用健康牙龈来源和患病牙龈来源的GMSCs与电纺聚己内酯支架结合分别培养,一段时间后观察显示两组细胞都存在成骨过程,但来自健康牙龈的细胞具有较高的矿化水平而来自患病牙龈的细胞显示矿化比较不明显,但其显示出更高的脂肪生成的倾向。这一研究不仅表明PCL支架材料可用于GMSCs细胞递送载体,而且该实验为细胞取材提供了一种新的道路,同时也提示我们未来骨组织工程中应谨慎选取细胞来源,以防其不能成骨或者成骨能力较弱不利于最终的结果。
2.3 聚乳酸-聚羟基乙酸(polylactic acid-glycolic acid,PLGA)
研究表明,PLA有可能引发动物体内邻近软组织的炎症反应,甚至引起骨吸收[24],基于聚乳酸的干细胞递送载体支架开发应充分考虑其安全性。为解决聚乳酸的上述问题,常将聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)聚合制成聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA),PLGA的机械性能、降解率和微结构等在生产过程中易于调控,具有适宜的孔隙率,利于种子细胞生长,并能促进毛细血管网的形成,是目前最成功的可生物降解聚合物之一,已成功应用于骨、软骨、角膜和神经等组织的再生[25]。虽然PLGA具有良好的生物相容性和生物降解性,但PLGA疏水性较强且缺乏细胞或组织的配体,不利于周围细胞和组织附着,其酸性降解产物也易导致发生无菌炎症,因此有研究通过不同方法对PLGA进行改性以便提高其作为间充质干细胞递送载体的性能。刘垚杉等[26]采用丝素蛋白对PLGA多孔微球进行改性,形成丝素改性PLGA多孔微球,其有利于GMSCs的初期粘附、增殖,且诱导成骨分化后在微球支架上有明显的钙结节沉积。丝素改性的PLGA多孔微球是良好的细胞递送载体,为进一步修复牙槽骨缺损提供了科学依据。
2.4 无机材料
羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)是目前研究最为广泛的无机材料,它与天然骨中无机盐的成分十分接近,并且其能在体内与天然的骨组织形成一定的骨结合,具有优越的机械强度[27],除此之外,将HA进行加工改性后还能获得其他特性,Mahon等[28]研制了一种具有免疫调节功能的含有仿骨纳米羟基磷灰石颗粒(bone mimetic nano hydroxyapatite particles,BMnP)的递送支架,通过动物实验,发现包封在BMnP功能化支架中的MSCs可在大鼠股骨缺损模型的缺损处沉积矿物质,还可观察到血管结构的生成,并且发现该支架还能够优先将巨噬细胞极化为抗炎的M2表型,并且以IL-10依赖的方式促进MSCs的成骨分化和矿化,该研究表明,在设计高效的骨诱导支架时,免疫反应的调节可能是一种新的策略。
2.5 其他聚合物
除此以外,用于间充质干细胞递送载体的聚合物还有聚-L-乳酸(poly-l-lactic acid,PLLA)[29-30]、聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)[31]、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)[32]、聚乙烯亚胺(poly ethylenimine,PEI)[33]等。这些聚合物各具有不同的特点,在牙龈间充质干细胞组织工程中作为细胞递送载体还有必要深入研究。
3 复合材料(composite material)
目前大部分支架材料都存在一定的不足,因此限制了单一支架材料的临床应用与研究,所以研究人员常将两种或者两种以上的材料通过物理、化学混合或改性的方式来提高其力学和生物学特性,利用其组成部分各自的优势,以期获得良好性能的复合支架材料。
3.1 PLGA相关复合材料
在引导骨组织再生中,学者们通过静电纺丝法制备了不同的PLGA相关细胞递送载体,如含有磷酸八钙(octacalcium phosphate,OCP)的PLGA/聚己内酯(PCL)纳米纤维膜(PLGA/PCL/OCP)[34]、电纺凹凸棒石(attapulgite,ATT)掺杂PLGA的复合支架PLGA/ATT[35]、鱼胶原蛋白(FC)和生物活性纳米羟基磷灰石(nanohydroxyapatite,n-HA)增强的PLGA纳米纤维膜[36]等,实验表明这些复合支架有利于骨髓间充质干细胞的粘附、扩散和增殖,增强碱性磷酸酶的活性,促进矿化骨结节的形成,有望成为有前途的GBR细胞递送复合支架材料。然而,这些PLGA复合递送载体是否能够促进牙龈间充质干细胞的骨分化潜能有待于进一步研究。
3.2 聚乳酸(PLA)-聚乙烯亚胺(PEI)复合材料
有学者将聚乳酸(PLA)和聚乙烯亚胺(PEI)复合形成支架材料(PLA-PEI),并将胞外膜泡(EVs)封入复合生物支架中,以模拟体内微环境,评价GMSCs的骨缺损再生能力,结果表明PLA-PEI-EVs具有较高的成骨诱导能力,将其植入大鼠骨缺损部位后,能够促进缺损部位骨的愈合[37]。
3.3 生物质复合材料(bio-composites)
生物质材料(biomass)是一种材料学的概念,是指主要由碳、氢、氧三种化学元素组成的有机高分子物质,其来源于动植物,降解产物可再次进入自然界循环,而且还具有来源广泛、价格低廉等优点,主要包括:胶原、壳聚糖、PLA、纤维蛋白原、β-葡聚糖、透明质酸等[38]。当聚合物复合材料中含有特定的生物相时,我们将其定义为生物质复合材料。生物质复合材料作为支架材料在骨组织工程、皮肤组织工程和伤口愈合等方面已经有了长足的发展[39]。Jindal等[40]将介孔硅酸锌(mesoporous zinc silicate,mZS)和壳聚糖复合制成mZS/CS生物质复合材料的复合支架,通过实验发现支架材料内的小鼠间充质干细胞可在体外进行矿化,mZS的复合改善了壳聚糖支架的孔隙率和降解率,并且该支架对金黄色葡萄球菌有抗菌作用,在临床应用时,能大大降低植入人体后感染的风险。此外,研究者们还开发出了明胶和黏液酸包裹的3D聚乳酸支架[41]、木葡聚糖-甲基丙烯酸/羟基磷灰石/SiO2支架[42]、银包裹的β-葡聚糖/纳米羟基磷灰石支架[43]等用于骨组织工程,明胶/壳聚糖电纺丝支架[44]等用于皮肤组织工程。这些都是生物质复合材料在组织工程中的应用,其应用大大减少了石油资源的使用,而且产物可生物降解和回收利用,更加符合法律和监管部门的规定,因此,生物质复合材料被贴上了生物可持续产品的标签,它的开发应用完美地契合了材料学和组织工程学的要求,未来与牙龈间充质干细胞的研究也将得到长久的发展。
3.4 其他聚合物复合支架
理想的支架材料应该有极高的生物相容性、无毒性、低免疫源性、可生物降解、价格低廉等特性,现有的支架材料还达不到应用时的理想要求,学者们不断探索和寻找各种新型的间充质干细胞3D复合支架材料,如聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯(PCL-PEG-PCL)复合支架[45]、聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯(poly3-hydroxybutyrate4-hydroxybutyrate,P34HB)复合支架[46]、P34HB/聚乙二醇(P34HB/PEG)复合支架[47]、P34HB/PEG/氧化石墨烯复合静电纺丝支架[48]等。这些复合支架作为骨髓间充质干细胞递送载体,明显地改善了细胞增殖、粘附,促进骨的形成,有望成为骨组织工程应用的新型支架,其在牙龈间充质干细胞组织再生中作为细胞递送载体还有必要进一步深入研究。
4 结 语
总之,干细胞组织工程中理想的支架材料应具有极优的生物相容性、无毒性、低免疫源性、可生物降解、价格低廉、具有一定的机械强度和可塑性、并且具有高孔隙性以允许高密度干细胞的植入,从而为干细胞提供更好的载体平台,细胞的增殖、迁移等代谢活动才能得到良好的保障。目前,在GMSCs组织再生中采用的细胞递送支架载体常见有上述天然高分子材料、人工合成材料、复合材料等,然而目前构建制备的GMSCs递送支架载体尚不理想。随着纳米材料、再生医学、仿生科学、细胞分离培养技术的不断提高,将会不断开发新型的GMSCs-3D细胞递送支架载体。在未来支架材料大量生产应用、石油资源短缺、生态卫生环境越来越受人们关注的背景下,随着绿色材料的进一步研究,对胶原、壳聚糖、PLA等可从自然界来源的生物材料制成的复合支架的研究也会更加深入,从而不断提高GMSCs在促进骨、肌肉、神经和牙周组织再生,促进伤口愈合,治疗口腔肿瘤、唾液腺疾病、种植体周围炎等方面的应用潜力。