醒脑静注射液对急性酒精中毒大鼠氧化应激损伤的保护作用*

姚丽梅 张阳儿 陈丁生 赵 威 王 奇 李伟荣△

（1.广东食品药品职业学院，广东 广州 510520；2.广州中医药大学，广东 广州 510405）

急性酒精中毒俗称醉酒，是指一次摄入大量酒精（乙醇）后发生的机体机能异常状态，对神经系统和肝脏伤害最严重。短时间内大量酒精进入机体会给患者带来较大伤害，甚至可以直接或间接导致死亡。急性酒精中毒的发生非常普遍，必须引起高度重视［1］。乙醇进入体内后，大部分在肝脏中被乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH）氧化，使肝脏处于氧化应激状态，对肝脏造成严重损伤［2］。

中医认为酒性湿热、味苦、有毒，饮之过多可导致疾病发生。早在《黄帝内经》中就有“酒性苦热”的记载，巢元方《诸病源候论》论及“酒性有毒，而复大热，饮之过多，故毒热气渗溢经络，浸溢脏腑，而生诸病也”，提出酒的毒性，并指出饮酒过度会导致机体诸病发生［3］。急性酒精中毒初期以解酒为主，临床上使用最多的中药是醒脑静注射液，疗效得到广泛确认［4］。醒脑静注射液由麝香、栀子、郁金和冰片4味药组成，具有开窍醒神、镇静止痉、清热解毒、解郁行气的功效，对酒精导致的意识障碍有显著的促醒作用。本课题组前期研究表明［5］，醒脑静注射液能促进急性酒精中毒小鼠体内乙醇的代谢，缩短小鼠昏迷时间，但对肝脏是否有保护作用并不清楚。本研究将采用急性酒精中毒大鼠模型，探讨醒脑静注射液的促醒作用以及对大鼠肝脏氧化应激损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠，雄性，体质量200～300 g，广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（粤）2018-0034。饲养温度24～26℃，相对湿度40%～70%，自由饮食水。所有实验均经广州中医药大学动物伦理委员会批准。

1.2 试药与仪器 醒脑静注射液，无锡济民可信禾药业股份有限公司，规格：10 mL/支，国药准字号Z41020664。ADH、ALDH、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）试剂盒，均购于南京建成生物科技有限公司，批号分别是：20180612、20180615、20181008、20170809、20170809。Trizol（批号：184608），购于美国赛默飞世尔科技有限公司；BestarTMqPCR RT Kits（DBI-2220）、Sybr Green qPCR MIX（DBI2043），购于广州粤穗生物科技有限公司。ADH、ALDH引物由广州粤穗生物科技有限公司合成。超声波破碎仪（美国Sonics公司）；KDC-220HR高速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；多功能酶标仪（美国铂金埃尔默有限公司）；普通PCR仪（美国PE公司）；Step One PlusTMReal-Time PCR System（美国Applied Biosystems公司）；Nano UV-3000微量核酸蛋白检测仪（美国Thermo scientific公司）；制冰机（日本Sanyo公司）；恒温水浴锅（正基仪器有限公司）。

1.3 分组与造模 将40只大鼠适应性喂养4 d后随机分为5组：空白组、模型组和醒脑静注射液低、中、高剂量组，每组8只。实验前12 h禁食不禁水，空白组大鼠腹腔注射生理盐水，模型组和给药组腹腔注射52%乙醇溶液［6-8］，注射量均为10 mL/kg体质量。

1.4 给药方法 待大鼠翻正反射消失后，空白组、模型组静脉注射生理盐水，参考文献［9-10］及预实验结果，醒脑静注射液低、中、高剂量组分别注射醒脑静注射液1.5、3.0、6.0 mL/kg，各组给药体积均为6 mL/kg，醒脑静低、中剂量组用生理盐水补足相应体积。

1.5 标本采集与检测 记录大鼠翻正反射消失维持时间，给予乙醇5 h后处死并立即取肝脏。剪取约1 g肝脏组织，按质量（g）∶体积（mL）=1∶9的比例加入PBS缓冲液用超声细胞破碎仪破碎组织，制成10%肝脏匀浆液，静置10 min后，4℃高速冷冻离心20 min（12 000 g/min），吸取上清液并分装。分别测定肝脏ADH、ALDH、SOD活性和肝组织蛋白、MDA、GSH含量。肝组织mRNA经提取分离纯化，逆转录成cDNA，再进行荧光定量反应。设计引物序列见表1。qRTPCR反应体系：cDNA模板1 μL，上游引物、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 8 μL，2×BestarTMq PCR Master Mix（SYBR Green）10 μL，总体积20 μL。放置于Step One PlusTM荧光定量PCR分析仪进行扩增反应。反应条件：95℃预变性反应2 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环40次。溶解曲线的反应条件：95℃反应1 min，55℃反应1 min，95℃反应15 s，循环1次。记录各组样品扩增反应的Ct值，通过内参均一化处理后，运用2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。

表1 扩增基因的引物序列信息

1.6 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件进行数据处理，多组间均值比较采用单因素方差分析，事后检验采用LSD。计量资料以（±s）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠翻正反射消失维持时间比较 见表2。与模型组比较，醒脑静注射液各剂量组均能缩短大鼠翻正反射消失维持时间，中、高剂量组差异具有统计学意义（P＜0.01）。

表2 各组大鼠翻正反射消失维持时间比较（h，±s）

表2 各组大鼠翻正反射消失维持时间比较（h，±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

组别模型组醒脑静注射液低剂量组醒脑静注射液中剂量组醒脑静注射液高剂量组n8 8 8 8翻正反射消失维持时间4.26±0.56 3.92±0.68 2.92±0.24**2.59±0.16**

2.2 各组大鼠肝组织ADH、ALDH、SOD活性比较 见表3。相比空白组，模型组肝组织中ADH和ALDH活性显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，醒脑静注射液中、高剂量组肝组织中ADH、ALDH、SOD活性显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各组大鼠肝组织ADH、ALDH、SOD活性比较（U/mg，±s）

表3 各组大鼠肝组织ADH、ALDH、SOD活性比较（U/mg，±s）

组别空白组模型组醒脑静注射液低剂量组醒脑静注射液中剂量组醒脑静注射液高剂量组n 8 8 8 8 8 ADH 4.83±1.94**1.81±1.12 2.58±0.77 3.77±1.65*3.69±0.79**ALDH 1.39±0.20**0.55±0.12 0.54±0.53 1.29±0.33**1.30±0.19**SOD 154.92±20.34 155.95±11.75 164.91±10.76 172.70±20.63*173.92±18.92*

2.3 各组大鼠肝组织GSH、MDA含量比较 见表4。相比空白组，模型组肝组织MDA含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，醒脑静注射液中、高剂量组肝组织GSH含量显著升高（P＜0.05或P＜0.01），对MDA含量无显著影响。

表4 各组大鼠肝组织GSH、MDA含量比较（μmol/g，±s）

表4 各组大鼠肝组织GSH、MDA含量比较（μmol/g，±s）

组别空白组模型组醒脑静注射液低剂量组醒脑静注射液中剂量组醒脑静注射液高剂量组n 8 8 8 8 8 GSH 2.72±1.36 2.27±1.04 2.67±0.94 4.57±1.89**3.51±0.21*MDA 1.12±0.21**1.63±0.41 1.62±0.31 1.44±0.24 1.54±0.31

2.4 各组大鼠肝组织ADH、ALDH mRNA表达量比较 见表5。相比空白组，模型组肝组织中ADH、ALDH mRNA表达量均显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，醒脑静注射液中、高剂量组ADH mRNA表达量显著升高（P＜0.05），低、中、高剂量组ALDH mRNA表达量均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表5 各组大鼠肝组织ADH、ALDH mRNA表达量比较（±s）

表5 各组大鼠肝组织ADH、ALDH mRNA表达量比较（±s）

组别空白组模型组醒脑静注射液低剂量组醒脑静注射液中剂量组醒脑静注射液高剂量组n 8 8 8 8 8 ADH 0.95±0.36**0.42±0.18 0.38±0.21 0.70±0.14*0.76±0.13*ALDH 1.11±0.26**0.13±0.18 0.55±0.10*0.63±0.18**0.51±0.17*

3 讨 论

急性酒精中毒以神经系统和肝脏损伤最为常见，机体摄入的乙醇大部分由肝脏代谢，由于其脂溶性较强，小部分可通过血脑屏障进入大脑，作用于脑神经细胞的代谢酶，使中枢神经细胞出现兴奋性表现。当机体摄入的乙醇过量，超出正常肝脏代谢范围，导致肝脏处于氧化应激状态，造成肝脏氧化应激损伤。酒精性肝损伤严重威胁酗酒人群的健康，已成为世界范围内亟待解决的重要公共卫生问题。中医认为酒为湿热之品，湿热易困遏脾胃，阻碍气机，脾运化功能失司，土壅则木郁，导致肝疏泄失常，气机郁滞，引起纳呆、腹胀、胁痛等症状。现代医学研究一般认为酒精性肝损伤与氧化应激、炎症、线粒体功能障碍、凋亡与乙醛毒性等密切相关，氧化应激损伤为首要原因［11］。

我国古代医家对急性酒精中毒的治法论述颇多，如明代医家周慎斋在《周慎斋遗书·卷八·伤酒》中谈到“酒客初病，发不甚重，解酒足矣，续自病重者，以内伤法立方，少加醒酒药味”，指出急性酒精中毒的中医治疗原则早期应以解酒为主，随着病情发展，应按照内伤疾病拟定治法与处方，同时配合醒酒药物。醒脑静注射液出自清代著名医家吴鞠通的《温病条辨》，是由中药经典复方安宫牛黄丸精简而成的水溶性静脉注射液，有效解决了传统丸剂起效缓慢、昏迷患者给药困难的问题。醒脑静注射液起效迅速，在临床上广泛用于脑梗死、脑出血急性期、颅脑外伤、急性酒精中毒等病症。方中麝香芳香开窍为君，栀子清热泻火、凉血解毒为臣，郁金活血行气、清心解郁、凉血解毒为佐，协同君药、臣药开窍通络，冰片引药上行为使。诸药合用，共奏开窍醒神、镇静止痉、清热解毒、解郁行气之功［12］。醒脑静注射液中所含的芳香开窍药麝香和冰片具有快速促醒作用。刘亚敏等［13］研究发现，麝香、冰片可降低脑缺血时的兴奋性神经递质天冬氨酸，升高抑制性神经递质γ-氨基丁酸和甘氨酸，对抗兴奋性氨基酸毒性，起到保护脑缺血神经元的作用，这可能是其芳香开窍机制之一。本课题组前期研究［14-15］表明，醒脑静注射液对酒精性昏迷动物模型具有促醒作用，机制与调控脑内谷氨酸和γ-氨基丁酸及相关受体NR2A、NR2B及GABAA功能与表达有关。进一步研究［16］发现，醒脑静注射液可增加急性酒精中毒大鼠外侧下丘脑区觉醒肽-1受体表达、减少腺苷水平、下调腺苷-1受体表达及平衡核苷转运蛋白1表达，达到促醒作用。

有研究［17-19］表明醒脑静注射液对大鼠脑缺血再灌注所致氧化应激损伤具有保护作用。为进一步明确醒脑静注射液使急性酒精中毒大鼠促醒的同时，对肝脏氧化应激损伤的保护作用及机制，笔者开展了本项研究工作。结果表明，与模型组比较，醒脑静注射液可显著缩短急性酒精中毒大鼠翻正反射消失维持时间，逆转由酒精引起的ADH、ALDH活力下降；基因表达结果也显示醒脑静注射液也显著提高肝组织ADH和ALDH的mRNA表达水平，与ADH、ALDH活力测定结果相一致。本研究中急性酒精中毒虽然对大鼠肝组织SOD活性和GSH含量无明显影响，但可导致肝脏氧化应激损伤，使肝组织产生大量MDA。与模型组比较，醒脑静注射液能显著升高SOD和GSH的含量，但对已产生的MDA无明显的消除作用，表明醒脑静注射液可阻止急性酒精中毒所致肝脏氧化应激损伤，对肝脏有保护作用，可能与方中栀子清热泻火、凉血解毒，郁金疏肝活血、行气解郁功效有关，其深层机制有待进一步研究。