喀斯特煤矿区土地利用类型对土壤养分、酶活性及化学计量特征的影响

夏国栋 朱四喜* 李武江 赵 伟 高 宁 赵 斌

(1.贵州民族大学 生态环境工程学院，贵阳 550025；2.国家民委喀斯特环境地质灾害防治重点实验室(贵州民族大学)，贵阳 550025；3.贵州民族大学 人文科技学院，贵阳 550025)

矿产资源开发可以促进社会经济发展，但是开发活动所产生的酸性废水会通过沉降、地表径流等方式对周围土壤、水体、大气造成污染[1]。矿区土壤成为最大的重金属污染受纳地，严重影响了生态平衡，危害人类身体健康，所以生态修复显得尤为重要[2-3]。目前矿区土壤的恢复主要表现在土壤养分和酶活性方面[4-5]。土壤养分和酶活性直接反应了土壤生态系统的完整性[6]，通常可以通过土壤酶活性的高低来判断土壤生物性的强弱从而判断该土壤的质量[7-10]，采矿活动会对土壤酶活性造成严重影响[11]。

土壤中一切化学反应都是依靠土壤酶所进行的，土壤酶与土壤养分之间的相互作用是判断土壤肥力的重要手段[12]。有研究表明酸性磷酸酶(ACP)能够促进脱磷速度，反映土壤中磷元素的形态转换[13]；而β-1，4-葡糖苷酶(BG)、β-1，4-木糖苷酶(BX)、纤维素二糖水解酶(CBH)、β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶(NAG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)在一定程度上也可以反映土壤碳氮磷的生物循环特征[14-15]，这些是土壤肥力的关键酶类，BG、BX、CBH影响了土壤有机质的分解；NAG、LAP与微生物的协同作用使土壤释放出碳、氮、磷等元素，提高有机质的降解速率，促进氮磷循环[16]。李武江等[17]发现，研究区重金属Cu、Ni、Zn超标较为严重，均超过贵州土壤重金属背景值，且矿山周边的农田重金属富集严重。

贵州省是我国典型的喀斯特高原山区，贵州省喀斯特地区存在水土流失、土壤易被腐蚀等问题。有研究表明全省有90%左右的耕地分布在喀斯特山区中[18]。喀斯特山区由于独特的地理条件，导致重金属污染迁移性强并且污染面源广，具有潜在的高生态风险性等特点[19-20]。目前，国内学者对西南喀斯特地区六盘水矿区土壤以及对矿区周边土壤酶活性和养分之间相互影响的研究较少。本研究以贵州六盘水某矿区周边不同土地利用类型土壤为研究对象，测定土壤养分与酶活性，分析喀斯特地区煤矿区不同土地利用类型对土壤养分、酶活性的影响；土壤养分和酶活性之间的影响规律，结合酶化学计量分析的方法，为矿区周围生态环境治理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2019年9月对位于贵州省六盘水市西北部，距离市中心20 km左右，海拔在1 650～2 200 m的矿区进行实地考察后将研究区根据不同土地利用类型分成耕地(G1G)、林地(G1L)、植物复垦区(G1Z)、居民区(JD)四个区域进行采样。采样点以50 m×50 m为一个样品单元，每个样品单元采用对角线法(即四角和中心点)，共5个土壤样品混匀后即为该样点的混合样品。4个采样区域采取两个深度a(0～20 cm)、b(20～40 cm)。用于测定土壤酶活性的样品采集后立即放入装有干冰的保温箱保温，之后带回实验室放入冰箱冷藏。用于测定土壤养分的样品放于自封袋，带回实验室后等待自然风干用于检测。

1.2 土壤养分的测定

土壤养分的测定参照《土壤农业化学分析方法》：测定土壤pH值(电位法)、有机质(SOM，重铬酸钾-浓硫酸氧化-外加热法)、全氮(TN，硫酸消煮-水杨酸钠法)、全磷(TP，硫酸消煮-钼锑抗法)、有效磷(AP，磷钼蓝法)、硝态氮(NO3-—N，硫酸肼还原法)、铵态氮(NH4+—N，水杨酸钠法)等理化指标。

1.3 土壤酶活性的测定

本研究共测定磷酸酶、β-1，4-葡糖苷酶(BG)、β-1，4-木糖苷酶(BX)、纤维素二糖水解酶(CBH)、β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶(NAG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)6种土壤水解酶，6种水解酶详细情况见表1。使用多功能酶标仪(SynergyH1，BioTek)进行荧光测定，在365 nm波长处激发，在450 nm处检测荧光。酶活性的单位为μmol/gh。

表1 矿区不同土地利用类型土壤养分含量

1.4 数据处理

用土壤酶化学计量分析，其计算公式如下[21]：

矢量角度=arctan2(X,Y)

上式中，矢量长度代表养分所受到能量的限制作用，而矢量角度则代表氮元素受到磷元素的约束作用，当矢量角度>45°代表磷限制，反之则代表氮限制。

本文数据采用Excel软件对原始数据进行初步整理，使用SPSS软件中单因素方差分析(One Anovn)和Duncand分别对土壤养分、酶活性及化学计量特征进行分析。采用联川生物云平台作土壤养分与酶活性之间的相关性分析。利用Canoco5软件中的冗余分析(RDA)来探索化学计量比与土壤养分之间的关系。采用Graphpad prism9.0软件作图，统计显著性水平p=0.05，冗余分析(RDA)则采用Canoco5作图，且表中数据表现形式为：均值±标准误差。

2 结果与分析

2.1 不同土地利用类型对土壤养分的影响

由表1可知，矿区周边土地不同利用类型土壤的pH值范围为5.66～7.29，耕地土壤酸碱度表现为中性；林地土壤偏酸性且深层土壤偏酸性更为明显；复垦区表层土壤比深层土壤的酸性更强，居民区土壤则表现为深层土壤酸性强于表层。各区域土壤的全氮、全磷、有效磷、有机质在不同土地利用类型下的不同土壤深度里的含量都有相同的规律，即表层含量均大于深层含量。其中，土壤的全氮、有效磷在土壤表层和深层的差异较明显。速效磷含量在耕地土壤中含量较高，而在植物复垦区土壤中含量相对低一些。有机质在植物复垦区的土壤中含量较高，耕地次之，林地相对较低。铵态氮、硝态氮含量均表现为耕地较高，居民区次之，植物复垦区最低。

2.2 矿区不同土地利用类型对酶活性的影响

图1是亮氨酸氨基肽酶、磷酸酶、β-1，4-木糖苷酶、β-1，4-葡糖苷酶、β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶、纤维素二糖水解酶分别在矿区不同土地利用类型的含量特征，植物复垦区的酶活性都显著低于其他土壤区。亮氨酸氨基肽酶在林地和居民区土壤中的活性较高，且表现为表层土壤>深层土壤，而在植物复垦区的活性相对较低，明显低于20 μmol/gh。磷酸酶在居民区的活性相对较高，其表层土壤酶活性明显高于深层土壤酶活性，而在耕地、林地和复垦区表现为深层土壤酶活性高于表层土壤，可能是因为表层土壤受污染较为严重从而对磷酸酶活性有抑制作用，明显低于20 μmol/gh，β-1，4-木糖苷酶、β-1，4-葡糖苷酶均表现为在居民区土壤的酶活性较高，在复垦区土壤的酶活性相对较低，且在耕地土壤中表现为表层土壤酶活性<深层土壤酶活性，而在林地和居民区表层土壤酶活性>深层土壤酶活性。根据李武江等[17]的研究，耕地表层土壤中酶活性受到抑制可能是由于重金属富集造成的。而在林地土壤中，养分较高的表层土壤酶活性高于养分相对低的深层土壤酶活性。此外，β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶和纤维素酶的酶活性在林地和居民区较高，其次耕地>复垦区，纤维素酶在耕地土壤中表现为表层土壤酶活性>深层土壤酶活性。整体来看，酶活性在植物复垦区土壤中最低，在其他土地利用类型中的排序为：林地、居民区>林地>耕地。

图1 不同植被演替阶段土壤酶活性Figure 1 Soil enzyme activity at different vegetative succession stages.注：不同小写字母表示同一种酶在不同演替阶段间显著差异(p<0.05)。图中(a)为亮氨酸氨基肽酶，(b)为磷酸酶，(c)为β-1，4-木糖苷酶，(d)为β-1，4-葡糖苷酶，(e)为β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶，(f)为纤维素二糖水解酶

2.3 不同土地利用类型土壤酶活性与土壤养分的相关性

土壤酶容易受土壤养分的影响，在土壤中变化非常敏感，常作为反映土壤养分高低的指标[22-24]。从图2中可以看出硝态氮与β-1，4-葡糖苷酶、β-1，4-木糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶呈显著正相关，而与磷酸酶呈负相关。有机质与亮氨酸氨基肽酶、β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶显著正相关，而与磷酸酶呈显著负相关。表明有机质能够促进亮氨酸氨基肽酶、β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶的生长，而高有机质的环境会抑制磷酸酶的滋生。pH值与纤维素二糖水解酶、β-1，4-葡糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶呈正相关，而与磷酸酶呈弱负相关。表明纤维素二糖水解酶、β-1，4-葡糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶在偏碱性的土壤环境更能生长，而磷酸酶更能生长于偏酸性的环境。全磷与磷酸酶、β-1，4-葡糖苷酶、纤维素二糖水解酶呈正相关，则表明磷酸酶的活性与磷元素的含量密切相关。而全氮与β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶、磷酸酶、β-1，4-木糖苷酶呈负相关，碳氮比与亮氨酸氨基肽酶、β-1，4-木糖苷酶、纤维素二糖水解酶呈显著正相关，而与磷酸酶呈负相关。为了深入研究土壤养分与酶活性之间的相关性程度，所以作出图3。

图2 矿山不同土地利用类型土壤养分与土壤酶活性的相关性网络图Figure 2 Correlation network diagram of soil nutrients and soil enzyme activities in different land use types of mines.

从图3中可以更直观地表现出土壤养分和所测酶的相关性程度。土壤硝态氮、碳氮比以及有机质除了与酸性磷酸酶呈现负相关外与其余所测土壤酶呈现正相关，相关性差异较大。硝态氮与β-1，4-木糖苷酶、β-1，4-葡糖苷酶和纤维素二糖水解酶的相关性显著，其中与β-1，4-木糖苷酶的相关性最强。有机质与亮氨酸氨基肽酶呈具有显著相关性，其相关性>0.4，并且与β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶也具有显著相关性。有机质与酸性磷酸酶呈显著的负相关关系，相关系数在0.3～0.4。含水率能严重抑制亮氨酸氨基肽酶的活性，除了酸性磷酸酶外，含水率对所测其他酶均有一定的抑制作用。总氮、氨态氮与所测酶相关性差异不显著，相关系数较小。总磷与速效磷与酸性磷酸酶呈现正相关，相关系数在0.2～0.4。速效磷能有效的促进β-1，4-葡糖苷酶和纤维素二糖水解酶活性的增加。pH值与酸性磷酸酶、β-1，4-葡糖苷酶、β-1，4-木糖苷酶、β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶的相关性不显著。

图3 矿山不同土地利用类型土壤养分与土壤酶活性的相关性热图Figure 3 Correlation heat map of soil nutrients and soil enzyme activities in different land use types of mines.

2.4 矿区不同土地利用类型土壤酶化学计量和矢量特征

表2是不同土地利用类型不同深度土壤胞外酶化学计量比和矢量特征表，表层土壤酶C∶N表现为居民区>林地>耕地>复垦区，深层土壤耕地与林地酶C∶N显著高于复垦区。酶C∶P表现为林地最高，复垦区最低，各土地利用类型的酶C∶P之间的差异不显著。酶N∶P在各土地利用类型中的范围在0.121～1.884，除了林地外，其他土地利用类型的酶N∶P均显著小于耕地。酶活性矢量长度介于0.018～0.120，矢量角度除了复垦区外其余土地利用类型均小于45°，研究表明，复垦区土壤受磷限制，其余土地利用类型受氮限制。不同土地利用类型C∶N、C∶P、N∶P的平均值为0.544、0.671、1.224，而矢量长度与矢量角度的平均值为0.064°和33.388°。通过公式lnU(BG+BX+CBH)∶lnU(NAG+LAP)∶lnU(ACP)得出不同土地利用类型中平均土壤酶化学计量比为C∶N∶P=1∶1.838∶1.502。

表2 矿区不同土地利用类型土壤酶活性的化学计量和矢量特征

图4为土壤酶活性计量比与土壤理化性质关系的冗余分析，结果显示两个排序轴分别解释了变异的54.40%(RDA1)与9.07%(RDA2)，共解释了变异的63.47%。有机质、全氮、C∶N对土壤酶N∶P具有显著的影响，而与酶C∶P有显著影响的是速效磷与硝态氮，速效磷、氨态氮与硝态氮对土壤酶C∶N有着正相关的关系。从图中可以看出RDA第一轴与全磷关系密切而RDA第二轴则与硝态氮、氨态氮关系密切，并且沿RDA1增大的方向全磷增加，酶C∶N、酶C∶P、酶N∶P减小。

图4 土壤酶活性计量比与土壤土壤养分的冗余分析Figure 4 Analysis of soil enzyme activity ratio and soil nutrient redundancy.

3 讨论

3.1 不同土地利用类型对土壤养分的影响

土壤养分含量在不同土地利用类型下的土壤中存在显著差异，这可能与受采矿活动对土壤的干扰程度及各区域的环境差异有关[25-26]，并且根据何淑勤等[27]的研究，土地利用类型的不同会导致土壤团聚体粒径以及稳定性的改变，土壤团聚体起到调控土壤养分循环的作用[28]，从而导致土壤养分在不同土地利用类型中存在显著性差异。在矿区的不同土地利用类型的土壤多偏中性和酸性，这也与段绍彦等[26]对矿区周边坡地、耕地土壤基础养分研究相似。研究发现林地与植物复垦区土壤养分较高，这是由于林地与植物复垦区自然植被分布密集，其根系与土壤接触面积较大，所以粘结土壤能力强，提高了有机质以及氮元素的积累[29]。本研究发现耕地土壤养分较低，这可能与农事活动与施肥有关[30]，而有研究表明，农业耕地土壤由于农业活动的原因，会使得土壤团聚体的平均重量直径(MWD)和几何平均直径(GMD)较低，从而影响土壤养分[31]。不同土壤深度中全氮、全磷、有效磷、有机质的含量均表现为土壤表层含量高于深层含量。耕地土壤的表层pH值略高于深层，这与莫爱等[32]对山地煤矿土壤的研究结果一致，矿区的其他区域土壤相对于其耕地土壤更显酸性。

3.2 不同土地利用类型对酶活性的影响

土壤酶是表征土壤肥力的重要指标之一[21]，作为生态系统中的天然工具，土壤酶直接参与了土壤物质循环、养分积累，并间接影响了土壤生态系统的稳定性[33]。根据张孝存等[34]的研究，土壤酶的分布会随着产酶生物以及生境理化性质在时空上的改变而发生改变，土壤养分在矿区不同土地利用类型的不同深度中土壤酶活性均表现为复垦区数值最低，其原因在于耕地、林地土壤养分充足且肥力高，而复垦区土壤有机质含量高但肥力较低，所以酶活性较低导致分解有机质的能力降低[35]。居民区土壤酶活性具有较明显的“表聚性”，可能是表层土壤受到周边居民生活的影响，居民生产活动会产生大量包含氮磷元素的物质，使得生物活跃性增强。而在其他区域土壤的酶活性“表聚性”不明显，其原因为表层土壤受到严重重金属污染从而抑制酶活性，这与卢怡等[36]对矿区土壤酶活性的研究结果类似。

3.3 土壤养分对酶活性的影响

土壤酶活性和土壤养分双方都起到相互影响的作用[37]。研究发现，对酶活性变化起驱动作用的土壤养分有：pH值、硝态氮、铵态氮、有机质、全磷、有效磷、含量水、C∶N等[38]。研究表明土壤pH值与纤维素二糖水解酶(CBH)、β-1，4-葡糖苷酶(BG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)呈正相关趋势，反映出CBH、LAP在碱性土壤中能有利于生物生长。研究发现碳氮比与LAP、β-1，4-木糖苷酶(BX)、CBH呈显著正相关，说明LAP、BX、CBH受C、N 的影响大。土壤全磷与酸性磷酸酶(ACP)、BG、CBH呈正相关，表明ACP的活性与磷元素的含量密切相关。有机质对酶活性有较显著的影响，有机质与LAP、β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶(NAG)显著正相关结果表明了不同生境下土壤养分的不同对酶活性具有显著的影响，根据孙毅等[33]的研究，酶活性的差异可能由不同土地利用类型土壤、气候、微生物群落变化以及植被的不同所决定的。

3.4 土壤养分对土壤酶化学计量比的影响

根据SINSABAUGH等的研究，全球生态系统化学酶计量比为C∶N∶P=1∶1∶1[39]，而本文C∶N∶P=1∶1.838∶1.502，高于全球水平。通过研究，发现研究区域各土地利用类型土壤具有较高的N、P转化酶活性，N、P元素在煤矿区土壤中较为缺乏，这样的结果也与刘立斌等[40]的研究一致，表明喀斯特地区土壤养分比较贫瘠，发现同为贵州喀斯特地区，土壤氮、磷代谢酶活性很高，土壤受氮磷元素制约。根据STERNER等[41]的研究，产酶生物可以根据不同生境的需要，对酶合成中的资源进行调配，从而增加或者降低C∶N∶P等元素的不平衡。根据资源分配理论[41]，在本研究区，当土壤中有机质、碳源比较充足时，产酶生物会偏向于增加N、P获取酶的分配，减少对C获取酶的分配。矢量角度除复垦区外其余土地利用类型均小于45°，表明复垦区土壤受氮限制，其他土地利用类型土壤受氮元素限制。在本研究中，化学酶计量比主要受到土壤理化性质的影响，研究也与孙毅等[33]的研究类似，而土地利用类型对土壤酶化学计量比的影响可能也与土壤碳氮磷的变化息息相关[42]。从RDA分析中看出有机质和化学酶N∶P和C∶P呈现正相关的关系，与C∶N呈现负相关的关系，从而得出有机质与氮磷相关代谢酶(NAG、LAP、ACP)关系密切，而pH值与土壤酶均呈现负相关的关系，酶C∶P、酶C∶N与C∶N呈现正相关的关系，这也表明碳相关代谢酶(BG、CBH、BX)与C∶N相关，以上研究表明土壤养分和土壤酶之间具有一定程度的趋向性，有机质与pH值同时调控土壤酶活性。

4 结论

1)该煤矿区土壤多显酸性，可以采用土壤调理剂来进行改良。土壤养分在矿区不同土地利用类型中表现为：林地、耕地土壤养分均较高，在复垦区土壤养分较低。含水率、全氮、全磷在耕地土壤中较为丰富，有机质在植物复垦区的含量相对较高。矿区土壤的不同深度中全氮、全磷、有效磷、有机质的含量均表现为土壤表层含量高于深层含量。在土壤表层与深层中，有机质的含量分布不均，可以通过种植绿肥提高微生物种类多样性来增加微生物数量，从而提高土壤肥力。

2)土壤酶活性在该煤矿区不同土地利用类型下的土壤中存在明显差异。所测酶在居民区和林地均表现出了较高的活性，而植物复垦区土壤酶活性最低。当前可以通过翻压绿肥的手段来活跃土壤生物过程从而提高土壤酶活性。各种酶活性的高低为：亮氨酸氨基肽酶>磷酸酶>β-1，4-葡糖苷酶>β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶>β-1，4-木糖苷酶>纤维素二糖水解酶。所测酶在林地、居民区、复垦区土壤下不同深度的含量均显示为表层土壤>深层土壤。

3)在土壤养分对土壤酶的相关性研究中发现，导致土壤酶活性受到抑制的原因是煤矿区土壤养分低和受到重金属污染。其中C∶N、有机质、硝态氮、铵态氮与酶活性均呈显著正相关，硝态氮可以很大程度促进酶活性的增加，氮源是有效驱动酶活性的主要因素之一。因此在土壤修复的过程中需要注意无机氮肥尤其是硝态氮肥的补充。有机质与化学酶计量比呈显著正相关，pH值呈现负相关，这也表明酶活性的高低受土壤养分影响，同时也受到pH值的调控。

4)表层土壤酶C∶N表现为居民区>林地>耕地>复垦区，深层土壤耕地与林地酶C∶N显著高于复垦区。酶C∶P表现为林地最高，复垦区最低，各土地利用类型的酶C∶P之间的差异不显著。不同土地利用类型土壤具有较高的N、P转化酶活性，N、P元素在煤矿区土壤中较为缺乏，复垦区土壤受磷限制，其余土地利用类型受氮限制。