石见穿HPLC指纹图谱研究

陈 莉 吴美兰 应松言

1 绍兴市上虞第二人民医院 浙江 绍兴 312300

2 浙江景岳堂药业有限公司 浙江 绍兴 312025

石见穿为唇形科植物华鼠尾草（Salvia chinensis Benth.）的干燥地上部分[1]，收载于《中国药典》1977年版一部，具有清热解毒，活血，利气，止痛的功效，用于脘胁胀痛，痈肿[1]。在临床上广泛应用于抗肿瘤的治疗[2-4]。石见穿产地主要为江苏、湖北、浙江等地[5]。目前石见穿药材的各省标准较为简单，仅性状、显微鉴别项。曲悦等[6]通过检测迷迭香酸的含量对石见穿药材的质量进行研究。现代研究中通过建立合适的指纹图谱方法可以更好地呈现中药的质量[7]。目前尚无石见穿相关的指纹图谱研究，通过相关实验研究建立石见穿HPLC指纹图谱有助于石见穿药材质量的控制。

1 仪器与试剂

岛津LC-20AT高效液相色谱仪、电子天平［BT-125D，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］、超声波清洗机（DL-480E，上海之信仪器有限公司）、电热恒温水浴锅（HHS-21-8，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、迷迭香酸对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号111871-201706，含量90.5%），甲醇乙腈为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。共收集不同产地石见穿药材11批，样品编号1～4产地为江苏宿迁，5～6产地为浙江临安,7～8产地为浙江淳安，9～11产地为湖北武汉。

2 实验方法

2.1 色谱条件：色谱柱：InterSustain C18，4.6mm×250mm，5μm，以乙腈为流动相A，以0.05%甲酸酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱，检测波长为360nm，流速1.0mL/min，柱温30℃。见表1。

表1 色谱条件

2.2 参照物溶液制备：取迷迭香酸对照品适量，精密称定，加75%甲醇制成每毫升含迷迭香酸40μg的溶液，作为参照物溶液。

2.3 供试品溶液制备：取本品粉末（过3号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察：分述如下。

2.4.1 专属性：精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，色谱图见图1。

图1 专属性图

2.4.2 精密度：取供试品溶液连续进样6次，以迷迭香酸峰为S峰，计算各特征峰的相对保留时间与相对峰面积，RSD值为0和1.23%，表明精密度良好。

2.4.3 稳定性：取供试品溶液分别在0、1、2、4、8、12、24小时进样，以迷迭香酸峰为S峰，计算各特征峰的相对保留时间与相对峰面积，RSD值为0.49和2.15%，表明24小时之内溶液稳定性良好。

2.4.4 重复性：取样品照“供试品溶液制备方法”制备供试品溶液6份，以迷迭香酸峰为S峰，计算各特征峰的相对保留时间与相对峰面积，RSD值为0和3.11%，表明重复性良好。

2.5 指纹图谱建立与相似度计算：取11批样品，依法制成供试品溶液，同前条件记录指纹图谱，见图2。11批样品共有峰为7个，其中6号峰为迷迭香酸参照峰。采用国家药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2.0版，以10批中药汤剂样品的HPLC图进行自动匹配，建立对照品指纹图谱，结果见图3。相似度计算结果见表2。

图2 11批石见穿样品指纹图谱

图3 石见穿对照指纹图谱

表2 11批样品相似度计算结果

3 讨论

通过对不同流动相（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸、乙腈-磷酸）的比较，选择乙腈-0.05%甲酸按梯度进行洗脱，分离效果最佳。在柱温25℃、30℃、35℃条件下洗脱，均能达到较好的分离效果。分别选用不同型号色谱柱（InterSustain C18、Agilent SB-C18、Ultimate AQ-C18），结果均适用。通过3D光谱图分析，迷迭香酸色谱峰最大吸收波长为328nm，为指纹图谱呈现更多色谱峰，选择检测波长为360nm。

浙江省中药饮片炮制规范2015年版收载石见穿基原为唇形科植物紫参（Salvia chinensis Benth.）或鼠尾草（Salvia japonica Thunb.）的干燥地上部分。其中“紫参”拉丁文名与华鼠尾草相同[8]，为同一植物。其他各省饮片炮制规范石见穿基原仅为华鼠尾草，未选用鼠尾草基原。经市场调研，鼠尾草基原应用较少，市场流通基原主流为华鼠尾草，实验所用药材基原均为华鼠尾草。指纹图谱的建立对药材基原的区别提供参考。