基于网络药理学和分子对接探讨虎杖治疗脓毒症的作用机制

李乐，黄浩，罗苑苑，温敏勇

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

脓毒症（sepsis），被定义为机体对感染反应失调所引起的危及生命的器官功能障碍[1-2]，是现代医学危急重症领域中的热点与难点。脓毒症归属于中医学“外感热病”“温毒”等范畴。中医药在脓毒症治疗领域具有广泛的应用前景[3-4]。虎杖是蓼科多年生草本植物虎杖（Polygonum cuspidatumSieb.etZucc.）的干燥根茎和根，别名花斑竹、大叶蛇总管、阴阳莲等，性寒，味苦，归肝、胆、肺经[5]，具有清热利湿解毒、活血散瘀止痛、止咳化痰的功效，临床常用于治疗湿热蕴结下焦、肺热咳嗽、热结便秘、水火烫伤等病证。现代药理研究发现，虎杖中主要含有蒽醌类（大黄素、大黄酸、大黄酚等），二苯乙烯类（虎杖苷、白藜芦醇等），黄酮类（橙皮素、芦丁、槲皮素等），香豆素类以及一些脂肪酸类化合物，能通过抗炎、抗氧化、改善细胞连接、抗细胞凋亡等多种作用改善脓毒症预后[6-12]。但虎杖治疗脓毒症过程中的关键成分及其具体机制仍不明确，因此本研究通过网络药理学和分子对接技术预测虎杖在脓毒症治疗中的主要活性成分及核心靶标，以期为虎杖在脓毒症治疗领域的进一步开发利用提供参考，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 虎杖有效成分及靶标的检索及筛选 选择中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及药物相似度（drug-likeness，DL）≥0.18作为筛选条件，获得虎杖的有效成分，同时结合相关文献及数据库进行补充。再利用TCMSP靶标预测模型获得虎杖有效成分的作用靶标。

1.2 疾病靶标的筛选 以“sepsis”为检索词，分别在GeneCards、OMIM数据库进行关键词检索，将获得的靶标进行合并、去重，得到脓毒症的疾病靶标。把检索得到的脓毒症靶标与虎杖有效成分靶标通过R软件合并处理，取两者交集并绘制韦恩图。

1.3 药物-成分-靶标网络的构建 把虎杖的有效成分、药物与疾病交集靶标导入Cytoscape 3.8.0软件中，剔除孤立的有效成分及靶标数据，得到药物-成分-靶标网络，节点表示虎杖、有效成分及潜在靶标。再使用软件自带的网络分析工具计算网络拓扑参数，根据节点连接度（Degree）、介度中心性（Betweenness Centrality）及紧密度中心性（Closeness Centrality）对网络图的网络拓扑结构进行分析。同时把药物与疾病的交集靶标导入STRING 11.0数据库中，限定物种为人类（Homo sapiens），最低相互作用阈值为0.4，获取蛋白之间相互作用的关系数据，再导入Cytoscape 3.8.0中绘制蛋白互作网络（PPI）图。

1.4 基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将药物与疾病的交集靶标通过R软件的Cluster Profiler包进行GO富集分析和KEGG通路分析，以P＜0.05和Q＜0.05作为筛选条件，得到差异有显著性意义的生物过程和靶标通路并绘制相关的柱状图。

1.5 分子对接结果验证 选择虎杖度值（Degree）前5位的有效成分作为配体，度值前5位的核心靶标作为受体，在RCSB数据库（https://www.rcsb.org/）下载有效成分及靶标对应的PDB文件或mol2文件，采用Autodock软件进行分子模拟对接。

2 结果

2.1 虎杖有效成分及靶标的筛选 在TCMSP中检索虎杖，得到化合物62个。以OB≥30%及DL≥0.18为筛选条件，加以结合相关文献筛查，共得到10个化合物（见表1）。得到虎杖作用靶标1 068个，通过与虎杖有效成分进行比对，去重后得到205个作用靶标。

表1 虎杖的有效成分Table 1 Active constituents of PolygoniCuspidati Rhizoma et Radix

2.2 脓毒症靶标的筛选 在GeneCards、OMIM数据中，以“sepsis”为检索词检索，经合并、去重后，得到脓毒症的疾病靶标共2 890个。取药物作用靶标与疾病靶标交集，得到63个交集基因靶标（见图1），即虎杖治疗脓毒症潜在靶标。

2.3 “药物-成分-靶标”网络的构建 把虎杖的有效成分、药物与疾病交集靶标导入Cytoscape 3.8.0软件中，剔除孤立的节点后，得到药物-成分-靶标网络（见图2），包含72节点，313条边。其中，靶标节点有63个，有效成分节点7个。利用Cytoscape 3.8.0网络分析工具计算网络拓扑参数，分析得到虎杖中最主要的前7个有效成分为槲皮素（quercetin，度值=138），木犀草素（luteolin，度值=77），β-谷甾醇（beta-sitosterol，度值=11），毒扁豆次碱（physovenine，度值=9），大黄酚（rhein，度值=5），儿茶酚（catechin，度值=5），6，8-二羟基-7-甲氧基呫吨酮（6，8-dihydroxy-7-methoxyxanthone，度值=4）以及最主要的前22个基因（见表2）。

表2 虎杖治疗脓毒症的前22个主要靶标信息Table 2 Information on the top 22 major targets for PolygoniCuspidatiRhizoma et Radix in the treatment of sepsis

图2 虎杖治疗脓毒症“药物-成分-靶标网络”图Figure 2“Drug-component-target network”diagram for Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix in the treatment of sepsis

2.4 PPI网络的构建 将63个交集基因导入STRING平台构建药物-疾病靶标PPI网络，取最低相互作用阈值为0.4，得到PPI网络数据。把PPI网络数据导入Cytoscape 3.8.0中，经过分析得到网络平均度值为19.4，最主要的前10个靶标分别是TP53（度值=49），IL6（度值=44），ESR1（度值=41），CASP3（度 值=41），HIF1A（度 值=40），VEGFA（度值=40），MYC（度值=39），EGFR（度值=39），PPARG（度值=37），CCND1（度值=35）。度值越大，说明该节点很可能就是关键成分或关键靶标（见图3）。

图3 虎杖治疗脓毒症的药物-疾病靶标蛋白互作网络图Figure 3 Network diagram of drug-disease target protein interaction for Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix in the treatment of sepsis

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 经过GO功能富集分析，得到1 321个GO条目，其中包含生物过程（BP）1 206个、细胞组成（CC）17个、分子功能（MF）97个。按校正P值从小到大选取每个分类的前8个条目绘制柱形图（见图4）。结果显示，生物过程主要涉及细胞对化学应激的反应、氧化应激反应、活性氧代谢过程、药物反应、凋亡信号通路的调控与负调控等；细胞组成则涉及膜筏、膜微区、RNA聚合酶Ⅱ转录调节复合物、髓鞘、基底等离子体膜、核被膜等；分子功能涉及DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、泛素或泛素样蛋白连接酶结合、半胱氨酸型内肽酶活性参与细胞凋亡过程、活化转录因子结合、氧化还原酶活性等。同时经过KEGG富集分析，共得到126条通路，按富集到通路上的靶标数目选取前20条通路绘制气泡图（见图5），其中，最主要的有脂质与动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路、人类巨细胞病毒感染、细胞凋亡、流体剪切应力与动脉粥样硬化、MAPK信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、AGE-RAGE信号通路等。结果表明，虎杖主要通过调节炎症反应、免疫反应及脂质代谢等通路治疗脓毒症。

图4 虎杖治疗脓毒症潜在靶标的GO功能分析Figure 4 GO functional analysis of potentialtargets of PolygoniCuspidatiRhizoma et Radix in the treatment of sepsis

图5 虎杖治疗脓毒症潜在靶标的KEGG通路分析Figure 5 Analysis of the KEGG pathway for potential targets of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix in the treatment of sepsis

2.6 活性成分与关键靶标分子对接结果 为明确所筛选的虎杖活性成分是否通过关键靶标发挥治疗脓毒症的作用，我们通过分子对接技术进行初步验证。利用AutoDock软件对度值前5位的有效成分与度值前5位的核心靶标进行分子对接，结果显示分子与靶标最低结合能均小于0，表明配体与受体均可进行自发结合。见图6。最低结合能≤-5.0 kJ·mol-1即表明药效分子与蛋白对接效果良好。结合能越低，表明分子与蛋白结合能力越强。本研究大部分结合能均≤-5.0 kJ·mol-1，其中β-谷甾醇、毒扁豆次碱、大黄酚的结合能均＜-5.0 kJ·mol-1，结合能力较强。TP53、PTGS1与有效成分结合能力为良好，代表有效成分可能主要通过这2个核心靶标治疗脓毒症。

图6 虎杖有效成分与脓毒症核心靶标分子对接结合能热图Figure 6 Molecular docking binding energy heat map of the active ingredients of PolygoniCuspidatiRhizoma et Radix and the core target molecules of sepsis

本研究选取结合能最低，即结合能力最强的有效成分与核心靶标在Pymol软件绘图（见图7）。其中，β-谷甾醇和木犀草素与核心靶标的结合能力最强，β-谷甾醇分布与血管内皮生长因子（VEGFA）在PRO-28处及 与TP53在GLU-97、SER-93处形成氢键，木犀草素则与PTGS1在GLU-465、CYS-36、CYS-47处和与IL6在SER-46、THR-42、ASP-159、NLE-48处形成氢键，木犀草素的结合能力强于β-谷甾醇，而毒扁豆次碱与RELA在PRO-47处形成氢键。

图7 虎杖有效成分与脓毒症核心靶标分子对接模式图Figure 7 Molecular docking diagram of the active components of PolygoniCuspidatiRhizoma et Radix with the core target molecules of sepsis

3 讨论

本研究通过网络药理学方法，筛选出7个虎杖主要活性成分，分别是槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、毒扁豆次碱、大黄酚、儿茶酚、6，8-二羟基-7-甲氧基呫吨酮，以及潜在的治疗脓毒症靶标63个。PPI网络显示度值前10位的靶标分别是TP53（49）、IL6（44）、ESR1（41）、CASP3（41）、HIF1A（40）、VEGFA（40）、MYC（39）、EGFR（39）、PPARG（37）、CCND1（35），表明这10个靶标是虎杖治疗脓毒症潜在的关键靶标。根据GO功能和KEGG富集结果显示，这些靶标主要涉及PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF、MAPK等信号通路。这些信号通路与炎症反应调节和免疫应答、细胞氧化应激、细胞自噬及凋亡密切相关。其中，PI3K-Akt信号通路可通过介导多种固有免疫细胞在脓毒症炎症反应与免疫应答的调控中发挥关键作用[13]。MAPK信号通路主要参与细胞生长分化、炎症反应、氧化应激等多种生理过程，对该通路的调控可发挥抑制细胞凋亡、减轻脓毒症器官损伤等作用[14]。严重感染、器官功能障碍以及免疫失衡始终是脓毒症病程中较为突出的几大难题，因此，本研究结果提示，虎杖在脓毒症治疗中可通过调控炎症反应、免疫应答等发挥多靶点效应。

在分子对接中，虎杖的核心化合物β-谷甾醇、毒扁豆次碱、大黄酚与TP53、PTGS1的结合能均＜-5.0 kJ·mol-1，说明这些核心化合物与受体蛋白的结合能力较强，进一步验证了富集分析得出的结果。其中，β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗抑郁、抗脱发等多种生物活性，在肾脏、心血管、呼吸系统等多种类疾病中具有较好的功效[15]。大黄酚具有抗肿瘤、抗炎、保护心肌损伤和神经等多种药理作用[16]。尚未发现毒扁豆次碱在脓毒症中的应用，有望成为新的潜在活性成分。在靶标方面，IL6是经典的炎症相关因子，对脓毒症预后的预测具有较大价值，且可作为新型冠状病毒肺炎危重症的临床指标预警因子[17-18]。VEGFA是调节血管通透性的细胞因子，分为促血管生成和促炎作用的VEGF-A165a和抗血管生成、抗炎和细胞保护作用的VEGF-A165b两型。但VEGFA在脓毒症不同阶段参考意义不同，目前尚无定论[19]。低氧诱导因子（HIF）是人体对适应低氧环境的关键转录因子，在急性低氧反应中发挥关键作用。脓毒症早期肠上皮细胞低氧能量障碍是肠功能障碍重要诱因，机体可能通过上调HIF-1α，促进能量代谢，改善脓毒性肠道黏膜屏障损伤[20]。人类肿瘤相关性最高的基因TP53、前列腺素内过氧化物合酶1（PTGS1）在脓毒症中的作用尚不明确，有望成为潜在靶点。

综上所述，本研究结果发现，虎杖可能通过β-谷甾醇、毒扁豆次碱、大黄酚等活性成分，作用于TP53、IL6、CASP3、HIF1A、VEGFA等关键靶标，发挥对PI3K-Akt、AGE-RAGE、MAPK等信号通路的调节作用，进而通过干预炎症反应、细胞自噬、免疫应答等机制治疗脓毒症。此结果进一步缩小了虎杖治疗脓毒症的关键成分、核心靶标与信号通路范围，初步揭示了虎杖治疗脓毒症的可能作用机制及物质基础，并在既往研究[8]基础上为虎杖治疗脓毒症的科学性与可行性提供了有力支持，可为后续虎杖治疗脓毒症的机制研究、临床应用以及含有虎杖的中药复方干预脓毒症治疗相关应用研究提供科学参考。本研究尚未进一步开展细胞及动物实验验证，今后可在此基础上深入探讨虎杖治疗脓毒症的相关作用机制并拓宽虎杖及含虎杖中药复方的临床应用。