再生障碍性贫血动物模型研究进展

黄晓桃 石博文 吴云霞△

1华中科技大学同济医学院附属湖北省妇幼保健院中西医结合科，武汉 430070 2华中科技大学同济医学院药学院药理系，武汉 430030

再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)，是一组造血组织功能衰竭综合征，其发病机制与造血干细胞损伤、造血微环境受损、免疫功能异常特别是T细胞功能亢进和细胞毒性T淋巴细胞直接杀伤骨髓造血干细胞以及淋巴因子介导的造血干细胞过度凋亡引起的骨髓造血细胞减少和功能衰竭有关。从病因方面AA可分为先天性和后天性，其中，先天性AA又称范科尼贫血(Fanconi anemia，FA)。现普遍认为，FA与22种不同基因突变所导致DNA双链对交联剂高度敏感、染色体损伤以及DNA双链交联修复功能缺失有关，将这些与FA有关的基因称为FANC基因。在实验室中常用的FA造模方法包括G2期电离辐射法和FANC基因敲除法。而后天性AA的动物模型则可基于其产生机制的不同，而采用不同的造模方法。本文将结合所得文献，介绍并总结当前最为常用的几种实验室AA动物模型造模方法。

1 AA动物模型的通用评价标准[1-3]

动物体态改变：AA造模成功的动物，包括小鼠、大鼠和兔等，常会出现体重下降、精神萎靡、耳廓苍白、眯眼弓背、毛发蓬松竖立且无光泽等变化。

血象变化：AA模型动物相对于正常的对照组动物出现全血细胞减少，白细胞(white blood cell，WBC)中以中性粒细胞减少最为明显，红细胞(red blood cell，RBC)及血红蛋白(hemoglobin，Hb)水平显著下降，网织红细胞(reticulocyte，RET)和血小板(platelet，PLT)数量减少。

骨髓象变化：AA模型动物的骨髓涂片中骨髓脂肪化明显，骨髓有核细胞减少，非造血细胞增多，镜下可见空泡数量明显增多，出现较大和特大空泡。

2 FA动物模型造模方法

2.1 G2期电离辐射法

Zahnreich S等[4]通过对G2期的皮肤和肺成纤维细胞进行X射线照射，发现实验细胞的H2AX(一种H2A组蛋白的变型)、53BP1(一种DNA修复因子)或RPA(一种与DNA双链断裂修复相关的蛋白)定量异常；同时通过细胞遗传学分析，发现在G1期及G2期照射后可见染色体过早凝聚，DNA双链之间出现无法修复的交联，表现出与临床上FA一致的细胞改变。

2.2 基因敲除法

2.2.1 直接敲除FANC基因 Zhang H等[5]在进行FA相关实验时采用了生物公司制作的Fancd2-/-基因敲除小鼠，使用基因敲除所得到的小鼠其FA发病机制与临床上人类FA发病机制具有高度一致性，因此在实验室进行FA相关实验时常使用FANC相关基因敲除小鼠。但由于使用FANC相关基因敲除小鼠所制作的FA模型并不能完全重现人类FA的所有临床表现，故而在运用方面亦具有一定的局限性[6]。

2.2.2 敲除可对FANC基因产生作用的其他基因 如Jamsai D等[7]在使用GGN-/-基因敲除小鼠时发现GGN的最大亚型GGN1可与FANC基因的关键组分FANCD2(一种由FANC基因编码的关键蛋白)相互作用，在敲除掉GGN基因后，敲除小鼠表现出对丝裂霉素C的高度敏感性并且出现大量染色体异常等类似于FA的临床症状。

2.2.3 骨髓细胞端粒缩短法 Bär C等[8]通过敲除小鼠的Trf1基因，使得造血干细胞出现代偿性增生而出现端粒迅速缩短，进而导致了基因敲除小鼠的WBC、Hb、RBC和PLT水平明显降低。但现在普遍认为，临床人类FA贫血的发病机制是通过作用于FANC基因介导的DNA修复途径导致DNA的交联和染色体破坏，因此通过该法制造的FA小鼠仅在外周血象及骨髓象表现与临床FA具有相似性。

3 后天性AA动物模型造模方法

3.1 物理方法造模

该方法是基于造血干细胞减少导致贫血的发病机理而设计的，过去常使用76 Gy60Co γ射线对实验动物进行全身照射(剂量率为1 Gy/min)，该法所制得AA动物模型基本符合人类临床AA发病特点且制作周期短[9]，但由于使用射线单独造模难以控制照射量，经常导致动物因过量照射死亡，并且还存在设备不便、需要特殊防护、操作繁琐、对人体存在伤害等问题，因此现在常使用物理射线联合化学药品(氯霉素、环磷酰胺)进行复合造模，所得动物模型具有较好稳定性，且操作比较简便。

3.2 物理联合化学方法造模

张乐等[10]将BALB/c小鼠于第1天予以3.0 Gy137Cs γ射线照射(剂量为91 Gy/min)，之后分别于第4天、第5天、第6天予以环磷酰胺、氯霉素腹腔注射；结果模型小鼠血液WBC和PLT水平迅速下降，Hb和RET显著减少；经骨髓象检查发现骨髓有核细胞数量显著减少，于镜下观察到大量脂肪细胞和非造血细胞增生；该动物模型符合AA的临床表现。通过该方法制得的AA小鼠模型骨髓衰竭持续时间长，生存率也相对稳定，因此在近几年的AA造模中常使用复合方法造模，而较少使用单独射线照射造模。

3.3 化学方法造模

3.3.1 苯 最早应用于AA造模的化学试剂是苯剂，苯及其代谢产物在体内超过一定限度可对造血系统产生严重伤害致使造血微环境损伤，从而导致AA的发生。贺今等[11]将小鼠背侧皮下注射玉米油与苯油的混合液(苯剂量2 mL/kg)，分别于造模第5天、第10天、第15天、第20天和第25天注射；最后一次注射后第2天抽查外周血象，可见其WBC、RBC、Hb、PLT和RET水平明显下降；通过其骨髓象检查发现，小鼠造血面积显著减少，脂肪细胞增多，骨髓间质血窦充血。通过苯间断注射诱导AA动物模型不仅使得外周血象各指标均显著下降，而且造模成功后没有引起小鼠死亡，因而此种造模方式明显优于射线照射造模。外周血免疫学分析结果显示，模型组CD4+细胞比例低于对照组，CD8+细胞比例高于对照组，CD4+/CD8+比例低于对照组；表明在实验动物模型的发病过程中有细胞免疫的参与，这与临床上AA具有一致性。

3.3.2 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)联合白消安 5-FU为抗代谢药，主要杀伤处于增殖周期内的细胞，而非增殖周期内的细胞则不会受到杀伤作用，且5-FU主要富集在骨髓中，其骨髓中浓度为血浆浓度2倍，因而可以导致造血功能损伤。白消安属于烷化剂，为细胞周期非特异性药物，由于其血液毒性将会对造血细胞进行杀伤，可与5-FU同用产生协同作用。苏攀柯等[2]将SD大鼠第1天予以5-FU腹腔注射150 mg/kg，第5天予以白消安蒸馏水悬液灌胃15 mg/kg；一周后进行外周血象检查，显示WBC、Hb和RBC水平均明显减少；骨髓涂片可见骨髓非造血细胞增生明显，脂肪化严重，骨髓有核细胞数量大幅减少，出现大空泡；该动物模型的血象及骨髓象较为接近临床人类AA。

3.3.3 环磷酰胺联合白消安 由于环磷酰胺与白消安均可导致造血干细胞损伤，Chen YF等[12]将ICR小鼠使用环磷酰胺40 mg/kg和白消安20 mg/kg联合皮下注射12 d后进行外周血象检查，结果与对照组相比，模型组小鼠WBC、RBC、Hb、PLT和骨髓有核细胞计数分别显著下降64.32%、42.33%、20.04%、61.53%和68.25%；骨髓检查发现骨髓有核细胞数量大幅减少，脂肪化严重，出现大空泡；这些指标表明该法所造的动物模型与临床AA的表现基本一致。

3.3.4 重组人γ-干扰素联合白消安 刘香等[13]选用重组人γ-干扰素联合白消安进行造模，他们通过使用干扰素以达到类似于免疫介导所致T细胞功能亢进的效果，从而使用较为简单的方法以制造与免疫介导方法相近的AA模型，因此此种方法也可归属于免疫介导方法。使用该法制造的AA模型在第7天时出现WBC、PLT、Hb水平下降，与对照组第7天相比具有显著差异，在第14天时AA模型鼠的血象与对照组比较仍显著下降，第7天与第14天血象比较则无显著差异。这表明使用该法所得到的模型鼠表现出与AA相似的血象变化，且该造模方法具有较好的稳定性。

除了上述方法以外，还有采用乙酰苯肼联合环磷酰胺腹腔注射以建立AA大鼠模型[14]以及使用氯霉素[15]进行AA造模，这些动物模型其病理表现也接近于人类AA。越来越多的研究表明，联合使用化学试剂制造AA动物模型，其机制都有免疫细胞的参与，病理表现较接近于人类AA的临床病理表现。

3.4 免疫介导法造模

免疫介导是通过诱导T淋巴细胞功能亢进并产生细胞毒性T淋巴细胞而导致AA的动物模型制造方法，由于T淋巴细胞功能亢进是临床AA最重要的发病机制，因此该方法制造的动物模型是最能反映临床状况的动物模型。该造模方法包括病毒感染和淋巴细胞输注。前者主要用于FA的基因治疗，Czechowicz A等[16]报道了由携带FANC相关基因的慢病毒进行儿童FA的临床基因治疗，而在实验室中普遍使用的是淋巴细胞输注法制造AA模型。Wu D等[17]将DBA/2小鼠通过颈椎脱臼法处死后收获胸腺并制备成细胞悬液，再将细胞悬液通过尾静脉注射进入经过Co照射4 h后的小鼠体内，第10天时检查其外周血象发现AA组小鼠WBC、Hb、RBC和PLT水平明显降低，而且其骨髓检查也出现了经典的AA病理表现。该法所制得的模型，同样有细胞免疫的参与，因此其发病机制与人类AA相近。虽然该模型制造周期短，但其操作繁琐，胸腺悬液制备需要严格无菌。

4 评价与展望

实验室中对于FA动物模型主要通过敲除小鼠相关基因制备，当前实验室经常使用的FANC基因敲除小鼠发病后的血象特点与人类相似，但基因敲除所导致的FA模型动物表现出的发育异常、贫血和癌症倾向并不能完全模拟临床FA症状[18-20]，同时靶向于FANC基因的治疗结果也均不理想[21-22]。

后天性AA动物模型在筛选AA治疗药物方面较为常用，其制备方法通常包括物理、物理联合化学、化学试剂联用以及免疫介导法。其中，化学试剂联用制造AA动物模型因为具有操作简便、试剂易得、评价方法成熟等优点而被大量采用，但是该法也存在与临床AA病理表现一致性不够高的缺点。物理、物理联合化学方法由于射线照射操作不便，因此较为少用，现在已经被化学试剂联合造模方法所替代。在4种后天性AA动物模型造模方法中，免疫介导法中的淋巴细胞输注法制造AA动物模型，与人类AA最为相似，但是其操作更加繁琐。后天性AA动物模型的另3种制造方法各有优缺点，但均有小鼠模型稳定性不够高以及外周血象(WBC、PLT、RBC、Hb)下降程度不一致的问题，因此在实际的实验造模过程中尚应根据具体实验需要进行选择和改进[23-24]。

中医药在缓解造血功能障碍、治疗AA方面具有独特的优势，疗效稳定，毒副作用少，临床选方用药可以从解毒、化瘀、化痰、补肾、健脾、益气、养血等多方面进行合理配伍以治疗。在研发新的防治AA中药新药过程中，我们需要合理选择契合度高的AA模型以便能全面、准确评估中药的疗效并推荐用于临床适合类型。以上模型可用于初步筛选，但如果要更加合理评估中医药疗效，则需要以辨证为依据建立中医相应AA动物模型则更好，目前这方面工作尚有很多不足，希翼对AA有兴趣的临床和科研工作者进一步探索新的中医证型AA模型和中西医结合模型，从而能充分评估和显示中医药在治疗AA方面的优势。