细胞自噬在免疫性血小板减少症中的作用机制研究进展

罗雅琴，黄 伟

(1.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014；2.山东省中医药研究院，山东 济南 250014；3.齐鲁工业大学/山东省科学院山东省分析测试中心，山东 济南 250014)

细胞自噬是一种自我消化现象，广泛参与细胞生命活动，与细胞生存或死亡密不可分。自噬不仅是细胞重要的内在保护机制，而且也参与多种疾病的发生、发展，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩病等多种自身免疫性疾病[1]。免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP)是一种机体自身免疫异常引起的血小板破坏过多的出血性疾病，以外周血小板减少、骨髓巨核细胞正常或增多为主要临床表现，严重者可出现颅内以及消化道出血等，影响患者生命[2]。目前，导致ITP发生的主要机制尚未完全阐明，除抗体介导的血小板破坏以外，多种细胞免疫机制的异常也参与了ITP的发生过程。研究表明，T、B淋巴细胞免疫失衡及巨核细胞功能障碍是ITP发生的中心环节[3-4]。近年来，越来越多的研究显示，自噬在ITP疾病的发生、发展中发挥重要作用。本文就细胞自噬在ITP中的作用及机制进行综述，以期为探索ITP的新型自噬靶向治疗药物提供参考。

1 细胞自噬概述

细胞自噬又称为“自我吞噬”，是细胞内细胞器与生物大分子被降解和回收利用的过程。细胞自噬主要分为3类：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。细胞自噬的过程分为起始、延伸、成熟和结束4个阶段[5]。起始：细胞受到自噬刺激后，细胞内会形成双层膜结构；延伸：双层膜的结构不断延伸并将底物包裹起来形成自噬体；成熟：在自噬的成熟阶段，闭合的双层膜结构与溶酶体融合；结束：自噬小体在溶酶体内多种酶的作用下被降解掉。细胞自噬广泛参与细胞多种重要生命活动，包括细胞凋亡、细胞更新、细胞死亡等，是细胞的一种重要内在保护机制；同时，细胞自噬也参与机体多种疾病的发病过程，自噬不足或过度都会导致机体发生病变。

2 细胞自噬调控机制

在细胞内，自噬被严格调节以维持细胞稳态。研究表明，细胞自噬通过响应细胞外或细胞内的应激和信号如饥饿、生长因子剥夺、内质网(endoplasmic reticulum，ER)应激、未折叠蛋白积聚和病原体感染等上调自噬体的表达。自噬体可由不同来源的膜形成，包括ER、高尔基体、线粒体和质膜[6]。自噬体的形成需要自噬相关蛋白(autophagy-related protein，Atg)的参与，目前已鉴定出至少35个Atg基因，大多数Atg基因有助于自噬体的形成，从酵母菌到人类进化过程Atg基因保持高度保守。酵母菌的Atg仅有一种形式，而哺乳动物所含Atg均有多种亚基，如Atg1、Atg4、Atg5、Atg8和Atg18，每个Atg在自噬过程中发挥特定功能[7]。目前研究证实，至少4种复合物涉及调控细胞自噬[8]，包括Atg1/Unc-51样自噬激活激酶1复合物、Atg6/Beclin1/Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶复合物、跨膜Atg 9/空泡膜蛋白1复合物和泛素样蛋白复合物[如Atg12和Atg8/微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)]，其中LC3分子由LC3Ⅰ 转化为LC3Ⅱ参与自噬体膜的形成，LC3Ⅱ常被作为评价细胞内自噬发生及自噬活性的主要标志物之一[9]。细胞自噬调控信号通路主要分为2大类：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)依赖途径和mTOR非依赖途径，目前研究主要集中在mTOR依赖途径。mTOR是磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)家族的重要成员，是细胞代谢的关键参与者之一，在维持营养有效性、能量以及机体代谢平衡中发挥重要作用[10]。mTOR作为自噬调控的中心环节，主要包括mTOR复合物1(mTOR complex 1，mTORC1)和mTORC2等2种形式。研究发现，mTOR在细胞内受多条信号通路的调控，包括PI3K/蛋白激酶B (protein kinase B,PKB/AKT)、细胞外信号调节激酶1/2、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-actived proteinkinase,p38 MAPK)、腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/结节性硬化症复合体(tuberous sclerosiscomplex,TSC)等[11]。mTOR非依赖途径主要受Class III-PI3K、RAS-MAPK、Ca-AMPK、p53、磷酸酶及张力蛋白同源物、ER应激等信号通路的调控[12]。目前，小分子自噬抑制剂如氯喹、3-甲基腺嘌呤、巴弗洛霉素A1、毒胡萝卜素、(±)BayK8644等已广泛用于临床和实验研究中，为研究细胞自噬与疾病的相关性提供了新的思路和工具。

3 ITP

ITP是临床上一种常见的出血性疾病，以外周血血小板减少为特点，严重者可危及生命。ITP患者因出血风险增大、疾病转归的不可预测性、对疾病的恐惧感、需长时间治疗、社会活动减少、影响工作等各种因素导致其生活质量严重降低，甚至其生活质量低于癌症患者[13]。ITP的发病机制主要为血小板破坏增多、血小板生成减少及T淋巴细胞免疫失衡。ITP的一线治疗方法主要包括：糖皮质激素、静脉注射用免疫球蛋白和抗-D免疫球蛋白；二线治疗方法包括：脾脏切除术、利妥昔单抗、促血小板生成素受体激动剂、环孢素、免疫抑制剂等。临床中有部分患者因治疗效果不佳，发展成为难治性ITP[14]。ITP患者体内血小板破坏增多，主要是因为血小板自身抗体介导的免疫失耐受，产生针对血小板糖蛋白(glycoprotein，GP)的自身抗体，包括抗血小板GPIb/Ⅸ和GPIIb/Ⅲ a抗体等，该抗体可与血小板表面的GP抗原表位结合，介导血小板被脾脏网状内皮系统中的单核巨噬细胞过度清除[15]。另有研究发现，ITP中细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs) 可通过穿孔素、颗粒酶B直接裂解血小板，造成血小板破坏增多；且CTLs可引起骨髓巨核细胞成熟和凋亡障碍，导致机体血小板生成减少[16]。但ITP的发病机制复杂，至今尚未完全阐明。

4 细胞自噬与ITP

细胞自噬不仅是一个重要的细胞内在保护机制，而且对于微生物细胞反应、主要组织相容性复合体抗原呈递以及淋巴细胞的分化、生存和增殖也起非常重要的作用。细胞自噬参与细胞的发育、分化、衰老和免疫。在生理条件下，自噬不仅调节免疫细胞存活和内源性细胞因子依赖性炎症等核心细胞过程，且在控制细胞内病原体中也起主要作用[17]。许多免疫过程包括病原体识别和破坏、抗原呈递、淋巴细胞发育和功能、体液免疫和炎症调节等高度依赖自噬[18-19]。有证据表明，自噬参与T、B淋巴细胞的激活和增殖以及决定B细胞存活的机制[20]。在病理情况下，自噬因不能对细胞外和细胞内的应激有足够的反应而出现异常[21]。研究表明，T、B淋巴细胞免疫失衡及巨核细胞功能障碍是ITP发生的中心环节[3-4]。因此，细胞自噬通过对T、B淋巴细胞和巨核细胞功能的调节作用对ITP的发生、发展起重要作用。

4.1 自噬调控T淋巴细胞在ITP发生、发展中的作用T淋巴细胞是ITP发病的关键成员，了解T细胞的功能缺陷对于阐明ITP的发病机制至关重要[22]。ITP是一种自身免疫性出血性疾病，通过T细胞和B细胞识别血小板抗原启动ITP的发生。健康人具有血小板特异性自身反应T细胞，可对外周刺激产生免疫耐受，而ITP患者存在活化的血小板自身反应性T细胞可增加促炎因子水平[23-24]。这表明ITP可能是由于血小板特异性自身反应性T细胞失去对外周的免疫耐受所导致。T淋巴细胞的发育、生存和增殖尤其依赖于自噬[25-26]。研究表明，细胞自噬可调控T细胞的存活、活化、病原体清除和记忆等生物功能，通过促进T细胞增殖和抑制死亡而有利于其存活[27]。王琦等[28]研究显示，与健康儿童相比，初诊自身抗体阳性的ITP患儿Treg数量显著降低，并伴随增殖相关蛋白AKT、细胞外调节蛋白激酶磷酸化水平及细胞自噬蛋白Atg5和Atg7水平降低。JIA等[29]研究发现，自噬基因Atg7缺失的T细胞导致细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B累积增加，从而抑制T细胞自身增殖。而自噬基因缺失的T细胞由于线粒体活性氧的堆积增加、促凋亡蛋白增加而促进T细胞凋亡[30]。细胞自噬缺陷不仅影响T细胞存活，而且影响其正常活化。研究发现，从老年小鼠获得的T细胞以及从健康志愿者获得的循环CD8+、CD57+衰老细胞均显示自噬功能减弱，这与DNA损伤增加有关[31]。因此，由于衰老导致的自噬缺陷可能导致T细胞的免疫低下。自噬还可通过介导T细胞受体(T cell receptor，TCR)下游信号通路的负向调控分子非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶1的降解促进T细胞活化[32]。在活化的T细胞中，CD8+T细胞更容易受到细胞自噬的调控。研究发现，Atg5-/-的CD8+T细胞更容易获得效应记忆表型，并产生更多的干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，这种表型变化伴随着葡萄糖代谢的增强，导致组蛋白甲基化的改变，以及糖酵解和免疫反应基因的上调[33]；自噬蛋白Atg7和NIP3样蛋白(Nip3-like protein X，NIX)介导的线粒体自噬对缺氧诱导因子-1a蛋白及脂肪酸代谢的调控与CD8+T细胞对特异性抗原的记忆有关[34]。研究表明，辅助型T细胞1(T helper 1 cell，Th1)可通过诱导自噬增强对入侵病菌的清除或促进细胞死亡[35]。巨噬细胞参与许多重要的免疫功能，IFN-γ加强了巨噬细胞在细胞先天性免疫中的作用。CHANG等[36]报道，IFN-γ可以增强刀豆球蛋白A诱导的肝癌细胞株发生自噬潮和细胞死亡。因此，推测T淋巴细胞自噬可能在ITP发生、发展中发挥了重要作用，但具体机制仍需进一步深入研究。

4.2 自噬调控B淋巴细胞在ITP发生、发展中的作用自噬对B淋巴细胞的生存起着复杂的作用，以确保免疫系统的正常。研究表明，B细胞经活化后高度增殖，引起细胞代谢过程加快，从而提供细胞增殖所需能量和物质等，而细胞自噬参与该过程并发挥重要作用[27]。自噬促进体内B淋巴细胞亚群的生存，包括发育中的前B细胞和B1细胞[37]。WATANABE 等[38]研究发现，自噬特别容易被凋亡的B细胞受体信号诱导;采用Cre-Lox P技术删除B淋巴细胞的Atg5，或重新辐照Atg5-/-小鼠胚胎肝脏祖细胞，可导致腹膜B-1B细胞显著减少。在B细胞发育中，Atg5-/-的祖细胞在将原B细胞转为前B细胞时表现出显著的缺陷，而骨髓B细胞的低效发育与增加的B细胞死亡有关，表明Atg5在发育过程中对B细胞的生存很重要。此外，B-1a B细胞需要外围Atg5的维护。可见，Atg5在细胞发育的不同阶段所起的作用不一样，但与细胞系传代数密切相关[39]。MARTINEZ-MARTIN等[40]研究发现，病毒感染激活初级滤泡B细胞发育为生发中心B细胞过程中，在自噬基因WIPI2调控下，细胞mTORC1表达上调，LC3-Ⅱ水平升高，线粒体代谢加快，从而促进B细胞分化；脂多糖刺激下浆母细胞的分化和存活主要依赖于Atg5介导的细胞自噬[41]。此外，有研究发现，B细胞特异性缺失Atg7的小鼠在针对流感疫苗免疫后显示正常的一抗反应，但在受到流感病毒攻击时未能产生保护性的二抗反应，从而导致高病毒载量、广泛肺部损伤和死亡率增加，表明细胞自噬在维持记忆B细胞对特定抗原的保护性抗体中发挥重要作用[42]。综上所述，自噬可促进B淋巴细胞的生存和早期B细胞祖细胞的发育。B淋巴细胞通过抗体偶联和抗体非依赖作用的结合在ITP的发病机制中发挥核心作用，自身反应性B细胞针对抗原产生的自身抗体，特别是针对抗GPIIb/IIIa和(或) GPIb/IX产生的免疫球蛋白G抗体，被认为在ITP的发病机制中起关键作用[43-45]。细胞自噬在调节B细胞稳态中发挥重要作用，Atg5和Atg7是主要的自噬调节蛋白，但该过程中是否涉及新的自噬途径及关键分子有待深入研究。

4.3 自噬通过调控巨核细胞在ITP发生、发展中的作用ITP是一种常见的自身免疫介导的出血性疾病，其中血小板膜蛋白变成抗原，刺激免疫系统产生抗体，导致血小板减少[46]。大约50%的ITP患者具有自身抗体，这些抗体不仅会破坏血小板，还会损害骨髓中巨核细胞的成熟和血小板生成[47]。研究发现，ITP小鼠未成熟巨核细胞/血小板和相应的祖细胞频率更高，且吞噬作用增加，导致外周血血小板计数减少[48]。MCMILLAN等[47]研究发现，慢性ITP患者的巨核细胞存在缺陷，向正常巨核细胞添加抗血小板抗体会导致巨核细胞增殖受损和异常倍性分布。CAO等[49]通过Atg7基因敲除小鼠模型发现，核心自噬机制对于正常的巨核细胞生成和血小板功能很重要；在ITP患者中，自噬的丧失阻止了巨核细胞的形成和分化，对血小板生成产生了负面影响，导致血小板体积变大、数量减少，最终严重阻碍了血小板的生成。为了评估血小板自噬的生理作用，OUSEPH等[50]通过对具有巨核细胞和血小板特异性删除Atg7小鼠血小板的体外分析发现，血小板聚集和颗粒包装存在缺陷，结果提示自噬与巨核细胞的成熟有关。细胞自噬对巨核细胞的作用主要表现在2个方面：(1)自噬受损影响造血干细胞向巨核细胞的分化。自噬在维持造血干细胞的干性和微环境中起重要作用，也是CD34+CD133+细胞自我更新和分化所必需的[51]。尽管自噬在细胞分化中的作用尚不清楚，但有证据表明其可以控制分化过程[52]。CAO等[49]研究发现，Atg5-/-小鼠模型表现出异常的巨核细胞分化和增殖以及血小板生成障碍，出现凝血功能降低，最终导致ITP。CD41和CD61是巨核细胞的2个标志物。研究发现，Atg7-骨髓细胞中CD41+CD61+细胞的百分比降低，并与凋亡增加和坏死有关；当自噬被bafilomycin A1抑制或雷帕霉素诱导时，观察到高倍性巨核细胞显著减少，CD41和CD61共表达细胞以及血小板形成减少；而当成熟巨核细胞的自噬发生改变时，前血小板的形成没有显著变化[53]。这一结果表明，在巨核细胞生成早期，自噬上调或抑制会影响巨核细胞和血小板生成，自噬是造血干细胞生存和分化为巨核细胞所必需的。(2)自噬异常影响巨核细胞向血小板的分化。造血、巨核细胞生成和分化以及血小板生成是连续的成熟过程，最后有组织地释放到血管中，经反复脱落产生循环的血小板[54]。成熟的巨核细胞可通过特定的细胞表面标记来鉴定，包括CD41、CD61、CD42和糖蛋白V。有研究通过Atg7-小鼠模型证明，自噬对正常的巨核细胞生成和血小板功能不可或缺，自噬通量的破坏可导致血小板聚集和黏附的损害[49-55]。另有研究报道，巨核细胞超微结构异常与骨髓巨核细胞凋亡相关，表明巨核细胞的损伤可能会降低血小板生成[56]。

5 结语与展望

细胞自噬广泛存在于真核生物中，通过平衡细胞内成分的合成和降解，调节细胞的稳态，是一个重要的细胞内在保护机制，对于维持细胞稳态、存活、更新至关重要。随着研究的不断深入，有关细胞自噬发生、发展的认识也不断加深，尤其是自噬调控机制的发现，使临床上可以更好地利用自噬治疗疾病和规避风险。

细胞自噬调控与ITP发病机制之间存在一定相关性，包括对T、B淋巴细胞以及巨核细胞功能的调节作用。ITP患者的自身抗原如GPIIb/IIIa和GPIb/IX，可能通过自噬而导致细胞内蛋白质降解形成，从而有助于ITP患者自身免疫的启动或持续。但考虑到细胞自噬复杂的生物学作用，自噬途径成员表达改变和自噬功能受损在ITP中的作用仍需进一步研究。通过对异常自噬途径的适当调节，调节机体免疫失衡，可减轻免疫介导的血小板破坏和(或)血小板生成的抑制。因此，有关自噬的未来研究可能会导致发现新的治疗靶标，这些靶标可为研发ITP治疗的个性化药物提供新的机会。