腺苷酸激活蛋白激酶在心房颤动发生和维持中的作用∗

李晓燕 钱玲玲 吴莹 王如兴

腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是调节糖、脂肪和蛋白质代谢以及维持细胞能量稳态的关键调节酶,是细胞能量感受器。在病理因素作用下,细胞内物质代谢紊乱可引起细胞能量代谢途径改变,从而导致细胞结构和功能异常,这称之为能量代谢重构。心脏较其他器官需要更多能量,因此,作为体内重要的能量调节剂AMPK 在心脏中作用尤为重要。AMPK 在心血管疾病中的研究已较多。近来很多研究发现AMPK 在心律失常的发生和发展中也发挥着作用[1],笔者主要综述AMPK 在心房颤动(简称房颤)发生和维持中的作用及其机制。

1 房颤的发生机制

房颤的病理生理机制与心肌细胞能量代谢异常也密切相关,房颤时能量代谢失衡可通过一系列信号通路促进心肌电重构及结构重构,从而促进房颤的发生发展[2]。房颤的心房高频兴奋和收缩影响了心房的能量代谢和循环供氧,改变了代谢需求与供给的平衡,也造成代谢应激,因此调节房颤患者的心肌能量代谢对房颤的治疗具有重要意义[3]。

2 AMPK 结构、激活及对心肌能量代谢的调节

2.1 AMPK 结构

AMPK 为异源三聚体,由蛋白激酶编码α亚单位(PRKAA),β亚单位(PRKAB)和γ亚单位(PRKAG)组成。这些异构体在AMPK 的稳定性和活性中作用不同,但都是其活性必不可少的。α亚基(两种异构体)是催化亚基,β亚基(两种异构体)和γ亚基(三种异构体)为调节亚基,可通过12种方式组合[4]。

AMPK 的α亚基具有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域,α1亚单位的Thr183 或α2 亚单位Thr172 位点的磷酸化为AMPK 激活的标志,这个位点的突变可以使AMPK 活性丧失[5]。AMPK-α1 亚型主要存在于脂肪组织中,AMPK-α2主要在骨骼肌、心肌中表达[6],血管内皮细胞有这两种异构体。β亚基除了NH-2末端的前65个残基,其余大部分高度保守,β1亚基几乎在所有细胞类型中表达,而β2亚基主要分布在肌细胞中,β亚单位还具有调节T 细胞的功能[7]。γ1亚基广泛表达在各种细胞,γ2和γ3亚型主要在骨骼肌细胞中表达[8]。

2.2 AMPK 的激活

AMPK 主要由三种互补机制激活:变构激活、上游激酶磷酸化α1亚单位的Thr 183或α2 亚单位的Thr172、抑制Thr183 或者Thr172 的去磷酸化。在动物体内,AMPK 激活主要受细胞中AMP/ATP比值调控。细胞内代谢功能障碍可增加细胞内AMP浓度,AMP与AMPK-γ结合,变构激活AMPK,使AMPK 成为上游激酶的更好底物以及磷酸酶的更差底物。ADP结合AMPK 也可减少AMPK 的去磷酸化。虽然细胞内ATP 浓度较高,但细胞内ATP 和AMPK的结合主要形式Mg-ATP 含量比较低,因此虽然ADP 和AMP生理浓度远低于ATP,但仍可与ATP 竞争激活AMPK[9]。

上游的AMPK 激酶对α亚基Thr-172的磷酸化对于调节AMPK 的功能至关重要,单独AMP结合AMPK 仅引起AMPK 5倍的活性增加,AMP联合上游激酶磷酸化AMPK(p AMPK)可使AMPK 活性增加1000倍。心脏中存在两种主要的AMPK 激酶:肝激酶(LKB1)和Ca2＋/钙调蛋白依赖蛋白激酶激酶(CaMKKII)。LKB1此前已被鉴定为肿瘤抑制因子,胞质内Ca2＋激活Ca MKKII磷酸化Thr172 激活AMPK,因此Ca MKKII可在没有能量压力的情况下激活AMPK[10]。蛋白磷酸酶(PPs),尤其是PP2A 和PP2C,可以通过Thr的去磷酸化调节AMPK 活性,AMP 和AMPK 结合后可减少PPs对AMPK 的去磷酸化作用[11]。

2.3 AMPK 对心肌能量代谢的调节

2.3.1 AMPK 对脂质代谢的调节 正常心脏所需ATP 的50%～75%由脂肪酸(fatty acid,FA)氧化产生。AMPK 激活可促进质膜脂肪酸结合蛋白(FABPpm)和脂肪酸转运酶(CD36)从胞质内向心肌细胞膜转运,从而增加心脏脂肪酸摄取。AMPK 激活可进一步抑制乙酰辅酶A 羧化酶(ACC1/ACC2),从而抑制乙酰辅酶A 转化为丙二酰辅酶A,丙二酰辅酶A 通过抑制肉碱棕榈酰转移酶(CPT1)阻止FA 进入线粒体,因此AMPK 激活降低丙二酰辅酶A 水平,导致FA 进入线粒体的摄取增加。因此AMPK 可通过增加心肌细胞摄取脂肪酸以及进入线粒体增多促进脂肪酸氧化[12]。

2.3.2 AMPK 对糖代谢的调节 AMPK 可促进葡萄糖转运蛋白(GLUT1和GLUT4)向心肌细胞肌膜的转运,以增加葡萄糖摄取。AMPK 还可抑制心肌细胞膜的GLUT4的内化,增加肌膜GLUT4 含量,促进随后的葡萄糖转运。AMPK 活化可激活磷酸果糖激酶2(PFK2),其可将果糖-6-磷酸转化为果糖-2,6-二磷酸酯,而果糖-2,6-二磷酸酯是PFKl的活化剂,PFKl是糖酵解调节的关键酶。AMPK 通过对PFK2的调节,间接激活PFKl,因此AMPK 可增加心肌葡萄糖摄取以及促进糖酵解[13]。

3 AMPK 在房颤发生和维持中的作用

LKB1为AMPK 的上游激酶,将LKB1flox/flox小鼠与表达α-MHC启动子中crea重组酶的转基因小鼠杂交,获得心肌细胞特异性LKB1缺陷小鼠。研究发现LKB1基因敲除(KO)小鼠在4周龄时有80%发作房颤,在5周龄12周龄全部发作房颤,而对照组无房颤发生;超声心动图提示:与对照组小鼠相比,LKB1-KO 小鼠的左房直径在数周内随着年龄的增长而增大,并且在12周时明显增大,LKB1的缺失导致AMPK 活性降低,并相应激活蛋白质合成主要调节因子的信号通路:m TOR、p70S6激酶和eEF2,用Ad-ca AMPK 转导可逆转siRNA 靶向LKB1 引起的心房细胞的肥大效应[14],因此LKB1 对于心房的正常发育的作用是通过AMPK 介导的。Ozcan 等[15]研究发现LKB1-KO 型小鼠47%在4周龄和95%在12 周龄表现出阵发性和持续性房颤,并且较野生型小鼠更常见房室传导阻滞和心房扑动。Kim 等[16]发现LKB1-KO 小鼠2周龄时发生心房纤维化和自发性房颤,至成年后心房间传导和双房电偶联异常,可能促进房颤的维持,考虑到LKB1对AMPK 的调节作用,研究者对AMPK 基因失活的小鼠进行了平行实验,AMPK 基因失活的小鼠2周时未发现房颤,可能与观察模型的时间较短有关,另一方面LKB1还调节其他12种LKB1底物的活性,这些底物被称为AMPK 相关激酶(ARK),它们在心脏中的作用目前仍不清楚。这些研究表明LKB1-KO 可导致AMPK 激活减少,促进房颤的发生和发展[17]。

房颤患者心房组织中存在明显的代谢紊乱。Harada等[18]定量研究了电刺激心房维持房颤1 周的犬的左房的p AMPK 水平,结果提示房颤可显著提高p AMPK 表达;作者同时检测了房颤患者的左房p AMPK 表达,阵发性房颤患者心房的p AMPK 比窦性心律组的p AMPK 高61%,而慢性房颤患者的p AMPK 降低了27%,提示AMPK 活化水平可能控制房颤的慢性化,它也表明初始p AMPK 表达增加可能是一种适应性/补偿性反应急性房颤发作时的能量不足;而慢性房颤时,稍大剂量的p AMPK 不能满足心房率增快不断积累的高能源需求,所以p AMPK 水平开始下降和逆转到了失代偿阶段,因此持续下降p AMPK 促进房颤的发展。

4 AMPK 在房颤发生和维持中的机制

4.1 AMPK 与心房电重构

AMPK 激活可减少快速起搏诱发房颤的模型的心房有效不应期[19]。AMPK 可激活钙通道Cav1.2,抑制钾通道(Kir2.1)从而延长动作电位时程(APD),减少房颤发作[20]。Kim 等[16]研究发现LKB1-KO 小鼠出生后第1天,其心房去极化时间延长,Nav1.5和缝隙连接蛋白40(Cx40)表达明显下调,心房肌细胞钠电流密度显著降低,同时观察AMPK 失活心脏的小鼠2周,其显示出与LKB1-KO 小鼠心脏的通道表达适度重叠,但保留了正常的结构、电生理功能和收缩性。

Harada等[18]研究发现在糖酵解抑制溶液中,心房肌细胞在4 min时钙离子浓度、钙瞬变(CaT)、细胞缩短(CS)均下降,在8 min时钙离子浓度、CaT、CS可恢复正常,而如果在溶液中加入AMPK 抑制剂Compound C,钙离子浓度、CaT 和CS在4 min时下降、且在8 min时未恢复。无论是正常酪氨酸溶液或糖酵解抑制溶液培养的心房肌细胞,给予2 Hz的刺激后,均可发现心房肌细胞的p AMPK、总AMPK(t AMPK)表达上升,且p AMPK 在t AMPK 中占比上升,提示心房肌细胞高频刺激可激活p AMPK;Compound C 可使咖啡因激活的L 型Ca2＋电流和肌浆网Ca2＋含量减少,AMPK 激活剂AICAR 可拮抗这些作用,并且可能增加CaT振幅以及增加CS程度;小干扰RNA 减少AMPK 表达可获得心房肌细胞舒张期Ca2＋浓度下降以及CaT 振幅下降。Eric等[21]在心力衰竭诱发房颤模型中发现,白藜芦醇可以上调钠钙交换体(NCX)、肌质网钙离子ATP酶(SERCA2a)和受磷蛋白(PLB)表达来改善舒张期Ca2＋的清除,减少钙超载从而预防房颤触发,可能与白藜芦醇对AMPK 激活有关。

研究表明使用二甲双胍可显著激活肾小球系膜细胞AMPK 表达以及Cx43表达,沉默AMPK 可导致Cx43表达减少,提示Cx43是AMPK 通路下游分子[22]。Li等[23]发现对犬模型急性起搏,其Cx43表达无明显差异,慢性起搏组Cx43表达下降,给予二甲双胍可增加Cx43的表达,减少房颤发生率和持续时间,两组间t AMPK 表达无明显差异,但未比较p AMPK 水平;体外快速刺激新生乳鼠心肌细胞12 h可使p AMPK 表达增加,沉默AMPK 减少AMPK 蛋白表达,也可减少Cx43 表达,因此二甲双胍可能通过激活AMPK 增加Cx43的表达,从而减少房颤的发作。但Alesutan等[24]发现AMPK 催化α亚基的优势亚型AMPKα1 加速了Cx43的泛素化,并降低了Cx43 在心脏组织中的蛋白表达,但并不明显改变Cx43的转录水平,泛素化的Cx43增多使缝隙连接减少,为各种心律失常提供了潜在的电生理基础,因此,AMPK 对Cx43的确切影响仍有待确定。

4.2 AMPK 与心房结构重构

LKB1-KO 小鼠p AMPK 水平明显下降,小鼠出现进行性双心房增大并伴炎性细胞增多、心肌细胞坏死和凋亡增加,炎症介质CRP、IL-5、TNF-a表达明显增高,细胞间基质和缝隙连接被打断、Cx40 和Cx43 表达减少[13]。Ozcan等[25]发现对LKB1-KO 小鼠分别予二甲双胍和阿司匹林灌胃,均增加心房p AMPK 表达;未经治疗的KO 组心房中的异质性斑片状纤维化为36%±3%,而经二甲双胍治疗后纤维化显著抑制至15%±2%,野生型(WT)小鼠心房组织纤维化较少,为3.7%±1%;对心房肌的进一步分析显示,与WT 心房相比,缺乏AMPK 的LKB1-KO 心房的Cx减少,包括Cx40(0.46±0.02 vs 1.2±0.04,P＜0.001)和Cx43(0.16±0.04 vs 2.3±0.7,P＜0.001);HE 染色显示:与WT 相比,未经治疗的LKB1-KO 心房中的心肌细胞紊乱、细胞间破坏、非心肌细胞浸润(淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞),细胞间基质被间质沉积破坏,二甲双胍给药减少了渗透和组织破坏,电子显微镜显示:与WT 相比,LKB1-KO 心房的心肌细胞和细胞外超微结构变形,包括肌原纤维紊乱、肌节紊乱以及膜和细胞器破坏;对心肌细胞线粒体的进一步分析表明,KO 小鼠的线粒体超微结构明显受损,但随着治疗的进行,线粒体的超微结构相对改善;未经治疗的LKB1-KO 小鼠的线粒体数量高于WT 小鼠,但与治疗小鼠相当,与WT心肌细胞相比,治疗组和未治疗组LKB-KO 小鼠心房心肌细胞的线粒体更大,未经治疗的KO 心房线粒体嵴密度显著低于WT 心房,经治疗的KO 小鼠的嵴密度高于未经治疗的KO 小鼠。

TGFβ-Smad2/3是引起心房纤维化和结构重构的重要信号通路,Kim 等[26]对HL-1细胞进行研究,发现血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可通过AMPK-JNK-TGF 信号通路促进炎症反应,免疫共沉淀检测发现AngⅡ诱导AMPK 与JNK 之间存在直接相互作用。Compound C 预处理HL-1后,JNK 磷酸化水平下降,AMPKα2 siRNA 转染HL-1 细胞可显著下调AMPKα的蛋白表达,并阻断AngⅡ诱导的JNK 磷酸化,在用Compound C预处理和AMPKα2 敲除进行预处理后,AngⅡ不再对TGF-β1和NF-κB产生任何影响;并且为了了解AngⅡ的作用,作者同时研究了房颤患者血浆中炎症与AngⅡ的相关性,将阵发性室上性心动过速(PSVT)患者作为对照,直流电复律(DCCV)后房颤患者作为研究对象,房颤患者血浆中AngⅡ浓度略有升高,DCCV 后,患者血浆AngⅡ水平恢复到与PSVT 对照组患者相似的水平;作者进一步证实低浓度的AngⅡ影响心房细胞的心房炎症,AngⅡ在皮摩尔范围略微增加了TGF-β1 的水平,表明房颤也与AngⅡ诱导的炎症相关。

4.3 AMPK 与自主神经系统

心脏自主神经系统对于房颤的发生和维持具有重要的调节作用[27]。炎症反应已被证实可调节神经重塑并参与心律失常的发生[28]。脂联素(APN)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质,是一种胰岛素增敏激素,与其受体结合后,可通过激活AMPK、p38丝裂原活化蛋白激酶和过氧物酶体增殖物激活受体(peroxidaseproliferationactivatedreceptor,PPAR)等信号分子发挥抗炎、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化等多种生物学作用。Zhou等[29]在犬心脏神经节注射APN,发现可延长心房部位的有效不应期(ERP)以及减少房颤的总易损窗口(∑WOV),快速心房起搏(RAP)可使所有部位的ERP 和∑WOV 值均显著降低,比如3 h RAP前后右上肺静脉部位的ERP值分别为(133±7)ms和(111±20)ms,APN 治疗显著减弱ERP 的减少和∑WOV的升高,注射APN 组RAP前后右上肺静脉部位的ERP 值分别为(142±11)ms和(138±9)ms。与单纯RAP 组比较,APN 给药组增加了心房p AMPK 表达,降低了NF-Kappa B的磷酸化表达,促进巨噬细胞表型由促炎状态向抗炎状态转变,从而减轻自主神经节的炎症反应,并降低交感神经的活性,以降低房颤的可诱导性。

4.4 AMPK 激活改善心肌能量代谢重构

心房糖原累积与RAP引起的房颤相关[30]。GLUT4表达增加可引起葡萄糖摄取增多,致心房糖原增加。Sun等[31]发现美托洛尔可减少睡眠呼吸暂停综合征(OSA)犬房颤的发作,OSA 犬心房的pSirt1 和p AMPK 表达下降、GLUT4和FAT/CD36 表达上调,使用美托洛尔可增加pSirt1和p AMPK 的表达,减少GLUT4 和FAT/CD36 合成,导致心房糖原减少从而降低OSA 犬房颤的发作和维持时间;应用间歇性缺氧和异丙肾上腺素(ISO)培育HL-1细胞建立体外细胞缺氧模型,联合应用美托洛尔可增加pSirt1和p AMPK 表达,而联合应用Sirt1抑制剂EX-527可消除美托洛尔对AMPK 激活的影响。

房颤患者左房组织中磷酸化Ca MKII 的表达增高,AMPK 活性增强,FAT/CD36 膜转位增加,促进脂质代谢[32]。PPARα、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α)在调节脂质代谢和线粒体生物合成中发挥重要作用。Bai等[19]将15只杂种犬分为三组,正常组(SR)组、RAP组(800次/分起搏6 h)、二甲双胍组[RAP前用二甲双胍(100 mg·kg－1·d－1)治疗2 周],测定左心耳和左房的心房ERP,与窦律组[(120.20±8.15)ms)]相比,RAP 组所有记录部位的ERP 均显著降低[(86.70±11.06)ms],而二甲双胍治疗组[(104.50±7.04)ms]可减弱ERP的降低(均P＜0.05);RAP组的ERP离散度显著高于窦律组(0.11±0.03 vs 0.04±0.02,P＜0.05),二甲双胍治疗逆转了离散度的增加(0.06±0.01 vs 0.11±0.03,P＜0.05);与窦律组相比,RAP组p AMPK 和t AMPK 表达增加,二甲双胍组p AMPK和t AMPK 表达进一步显著增加,RAP 组PPARα、PGC-1α和VLCAD(脂肪酸氧化的初始限速酶)表达下调,RAP 组p AMPK 表达增加促进FAT/CD36表达导致脂肪酸转入细胞内增多,而VLCAD 表达下降导致脂肪酸代谢下降,从而导致脂质在细胞内堆积,二甲双胍组p AMPK、PPARα、PGC-1α和VLCAD 表达均增加,减少脂质堆积,该研究表明二甲双胍也可能通过激活AMPK 抑制房颤中脂质代谢重塑从而减少房颤发作。

王宇超等[33]发现心脏外科手术合并房颤患者AMPK、PGC-1a表达较窦性心律下降,单因素Logistic回归分析显示AMPK、PGC-1α和TFAM(线粒体转录因子A)为术后早期房颤的保护因子,但房颤和AMPK/PGC-1α通路之间因果关系还不得而知。类风湿性关节炎可引起心房重构,导致房颤的发生和维持。Zhang等[34]将三组雌性Wistar大鼠(8周龄)分为:对照组、胶原诱导关节炎(CIA)组和白藜芦醇组。CIA 组大鼠房颤诱导率和持续时间显著增加,白藜芦醇可降低房颤诱导率和持续时间;CIA 还增加了心房和血清IL-6和TNF-a水平,并诱导心房凋亡和纤维化,白藜芦醇可减轻这些作用;CIA 组p AMPK、PGC-1α表达下降,白藜芦醇组p AMPK、PGC-1α表达增加,提示白藜芦醇对类风湿性关节炎诱导的心房结构和代谢重构具有保护作用,这些实验提示AMPK/PGC-1α信号通路可能通过能量代谢障碍参与房颤的过程。

4.5 AMPK 与氧化应激和炎症反应

氧化应激与炎症反应可引起心肌细胞凋亡以及促进心肌纤维化,导致心房电重构和结构重构是房颤发生和发展的重要原因[35]。Liu等[36]发现漆黄酮改善左房扩张、心房炎症、纤维化和心肌梗死后房颤易感性,其使用离体灌注心脏的电生理记录显示,急性心肌梗死后房颤诱导率较高,房颤持续时间延长,房间传导时间、心房ERP 均显著延长,应用漆黄酮可减轻这些延长;发作房颤时p AMPK 表达增加,加用漆黄酮可进一步提高p AMPK 表达,并且可减少核因子-Kappa B p65的表达,从而减少心房炎症反应降低房颤的易感性。Ghezelbash等[37]发现长期快速起搏心房可使左房氧化应激增加,H2O2水平升高,可降低p AMPK 导致LKB1/AMPK 通路失活,从而导致房颤的发生。相关实验提示氧化应激和炎症反应可通过AMPK 影响房颤的发生发展。

5 结语

细胞能量代谢与房颤密切相关,而AMPK 作为能量感受器,在房颤的发生发展中有多方面的作用。AMPK 可改善心脏能量代谢、影响心肌细胞钙离子表达、改善心房电和结构重构。房颤的临床危险因素与代谢应激和/或AMPK活性减弱导致的AMPK 需求增加有关,临床数据也表明,AMPK 激活可减少高危人群的房颤发生。因此以AMPK为靶点(如二甲双胍、脂联素、白藜芦醇)可能提供一种潜在的房颤的治疗策略。