外泌体非编码RNA在胰腺癌诊疗应用中的研究进展

刘宗林 程春东 王拥卫

哈尔滨医科大学附属第一医院胰胆外科 肝脾外科教育部重点实验室，哈尔滨 150000

【提要】 外泌体是由细胞分泌的40～150nm的纳米级囊泡，含有微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(circRNA)等多种非编码RNA。越来越多的研究表明，来源于外泌体的非编码RNA具有高度的稳定性和组织特异性，在胰腺癌的发生和发展中起着重要作用，同时，也可以作为指导胰腺癌临床诊断和治疗的特殊生物标志物。

近年来，外泌体由于在细胞功能方面的作用，特别是在肿瘤发生、发展过程中发挥的作用，引起了研究者越来越多的关注[1-3]。外泌体是由细胞分泌的纳米级囊泡，大小为40～150 nm，其内包含DNA、RNA、脂质、蛋白质等血浆物质，广泛存在于人的尿液、唾液、脑脊液中，通过进入受体细胞，传递信息，从而发挥介导细胞间通信的作用。外泌体参与免疫反应、呈递抗原及RNA转运、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等多种生物学过程。近年来越来越多的研究证实外泌体中的非编码RNA在胰腺癌的诊断及治疗中发挥重要的作用。本文就外泌体非编码RNA在胰腺癌的诊断、预后判断及治疗等方面的潜在价值以及应用做一综述。

一、外泌体的概述

外泌体是由johnstone等于1987年在体外培养绵羊网织红细胞时发现的，起初人们认为外泌体仅仅是网织红细胞在成熟过程中移除转铁蛋白受体的“排泄小泡”，直到近些年来随着对外泌体研究的深入，其在细胞间的通信作用才逐渐被人们所认知。外泌体形成的最初阶段是细胞膜向内凹陷形成核内体，核内体在成熟的过程中不断地向内萌发，继而形成含有腔内小泡的多泡小体，其内包含核酸以及可溶性蛋白质成分，多泡小体通过与细胞膜融合将外泌体由原细胞释放到细胞质中。目前，内吞体分选转运复合体被广泛认为在外泌体的形成和分泌过程中发挥重要调节作用。除此之外，外泌体中的Rabs蛋白是外泌体与受体细胞融合过程中重要的调节因子。外泌体源性的非编码RNA自身稳定性比较高，其分离、提取的方法通常根据外泌体不同的形态、密度、大小和表面蛋白标记而不同，目前主要有试剂盒法、超速离心法、超滤离心法、磁珠免疫法、交流电动微阵列芯片装置法等，其中最为广泛应用的是超速离心法和试剂盒法[4]。但以上方法均存在生产率不足、分离纯度不高的问题。近年来，出现了一些新的外泌体分离方法，如微流控器件、纳米等离子体增强散射、膜介导的外切体分离和芯片实验室等。虽然缺乏实验室测试经验和临床前实践，但这些方法将有望提高外泌体的生产率以及纯度。

二、外泌体非编码RNA与胰腺癌的关系

1.外泌体非编码RNA与胰腺肿瘤细胞增殖的关系：增殖失调是肿瘤转化中最重要的因素之一，研究表明，外泌体非编码RNA通过激活关键的信号转导途径在肿瘤细胞增殖中发挥重要的作用[5]。Li等[6]发现肿瘤产生的miR-222可以通过调控或重新等位p27来影响肿瘤细胞间的相互作用，进一步诱导附近的肿瘤细胞增殖。Fu等[7]的研究表明，外泌体来源的miR-98-5p表达降低不仅下调丝裂原活化激酶4(mitogen-activated protein kinase,MAPK4)进而促进胰腺癌细胞的增殖,而且激活了MAPK/ERK通路，该通路在肿瘤形成中至关重要。此外，Wang等[8]报道了外泌体miR-182通过靶向调节在细胞周期检查点中发挥关键作用的pri-TrCP2，正向调控细胞的增殖能力，从而在胰腺癌的进展中起到重要的作用。一直以来，放疗后肿瘤细胞加速再生被认为是导致治疗失败的重要原因之一[9]。Chen等[10]发现肿瘤细胞死亡后释放出的外泌体刺激残余肿瘤细胞重新增殖，而circRNA可能作为外泌体的重要物质参与肿瘤细胞的再增殖，外泌体circ0002130-外泌体miR4482-3p-NBN相互作用网络提示潜在的海绵化miRNA和靶mRNA。最近，M2巨噬细胞被发现与胃癌和乳腺癌相关，其在胰腺癌的进展中同样发挥作用。Yin等[11]发现,敲除M2巨噬细胞外泌体中的lncSBF2-AS1可促进miR-122-5p的表达，进而抑制其下游X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)的表达，从而抑制胰腺癌细胞的增殖。这在一定程度上揭示了M2巨噬细胞外泌体源性的lncSBF2-AS1与胰腺癌相互之间的关系。

2.外泌体非编码RNA与胰腺肿瘤细胞侵袭和转移的关系：侵袭和转移是恶性肿瘤的基本特征，也是肿瘤复发、疾病恶化甚至最终死亡的病理基础。胰腺癌具有高度的侵袭性和转移性，这是胰腺癌治疗效果差的主要原因。肿瘤细胞可以通过侵袭和转移侵犯邻近组织或者转移到远处，并在其他组织及器官中定植。外泌体非编码RNA通过多种机制调控胰腺癌肿瘤细胞的自身生长及肿瘤微环境最终促进胰腺肿瘤细胞的侵袭和转移。在衍生自胰腺肿瘤细胞的外泌体介导胰腺癌发展的进程中，含在外泌体内的非编码RNA有助于肿瘤细胞的侵袭和转移。有研究报道外泌体miR-21在胰腺导管腺癌肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)的表达中异常活跃，这无疑对胰腺癌肿瘤细胞的侵袭和转移具有重要意义[12]。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是胰腺癌进展过程中的一个重要事件，EMT可以促进肿瘤细胞的局部浸润以及远处转移[13]。研究发现，通过敲减外泌体miR-429和外泌体miR-141的表达可以抑制胰腺癌肿瘤细胞的增殖和转移，并同时提高了胰腺癌中EMT主要调控因子的表达效率[14]。Hu等[15]研究发现，双特异性磷酸酶(dual specificity phosphatase,DUSP)是外泌体miR-361-3P的直接作用靶点，而DUSP2可以通过直接导致ERK通路的失活来参与miR-361-3P诱导的EMT，表明miR-361-3P在胰腺癌的EMT中发挥调节作用。Li等[6]发现从胰腺导管腺癌细胞分泌的外泌体中分离的lncRNA Sox2ot可通过充当竞争性内源RNA促进EMT。Ma等[16]发现胰腺星状细胞来源的外泌体miR-21可通过Ras/ERK通路促进肿瘤细胞的迁移，并诱导实现EMT。此外，lncRNA Sox2ot过度表达与胰腺导管腺癌患者的肿瘤淋巴结转移和总生存率相关，其表达水平在肿瘤切除后降低[17]。Li等[18]研究发现,外泌体circRNA(circ-PDE8A)的高表达与胰腺导管腺癌患者的淋巴管浸润以及晚期TNM分期和不良的生存率相关，circ-PDE8A通过miR-338/MACC1/MET或AKT途径促进胰腺导管腺癌细胞的侵袭性生长。血管生成是不同肿瘤细胞发生和发展过程中的又一重要事件，肿瘤细胞在生长的过程中，需要不断形成新的血管来为肿瘤组织提供营养物质的供应。越来越多的文献证明外泌体非编码RNA在胰腺癌血管生成方面发挥重要作用。Shang等[19]研究发现，携带miR-27a的外泌体可以通过B细胞异位基因2(B cell translocation gene 2,BTG2)在胰腺癌中促进人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cell,HMVEC)的血管生成。

三、外泌体非编码RNA在胰腺癌诊断及预后中的应用

胰腺癌早期缺乏特异性症状，而作为临床常规筛查的肿瘤标志物CA19-9的灵敏度和特异度相对较低[20-21]。外泌体富含蛋白质、mRNA及非编码RNA，可以充当细胞间RNA转移的介质，保护其中的RNA不被RNA酶降解，从而确保血液循环中RNA的稳定性[22]，目前已开展大量关于外泌体提高胰腺癌早期发现率的研究，研究热点为蛋白和非编码RNA，其中非编码RNA中的miRNA作为胰腺癌诊断和预后的生物标志物的潜力受到越来越多的关注[23]。

有学者检测了49例患者(22例胰腺癌、6例胰腺良性肿瘤、6例慢性胰腺炎、7例壶腹癌)及8例健康对照者的血清外泌体miRNA，结果发现与健康对照组相比，49例患者miR-17-5p和miR-21表达明显增高，其作为肿瘤标志物的灵敏度及特异度分别为72.7%、92.6%和95.5%、81.5%。同时该研究结果显示miR-17-5p在转移和晚期胰腺癌中表达增高，表明其可以作为不可切除胰腺癌患者的生物标志物[24]。同时在miR-10b、miR-550、miR-196a、miR-1246及miR-451a的研究中也得到相似的结果[25-28]。这些结果表明从胰腺癌细胞中分离的外泌体miRNA可以作为早期诊断胰腺癌的生物标志物。除了血清外泌体标志物外，唾液中外泌体miRNA在诊断胰腺癌方面也具有较大潜力。Machida等[29]在包括12例胰胆管癌患者和13名健康者的研究中发现，唾液外泌体miR-1246和miR-4644可以作为胰胆管癌早期生物标志物，灵敏度及特异度分别为66.7%、100%和75.0%、76.9%。

外泌体非编码RNA在进行预后评估方面同样具有较大潜力。有研究证实胰腺癌患者血清外泌体中miR-155异常高表达，且与胰腺癌患者无病生存期密切相关，同时与组织中miR-155具有高度相关性，提示外泌体miR-155可作为胰腺癌患者预后的评判指标[1]。Takahasi等[28]研究证实外泌体miR-451a在术后复发的胰腺癌患者中显著增高，miR-451a高表达与胰腺癌患者的总生存期和无病生存期密切相关。上述研究主要集中在胰腺癌患者和健康人体外泌体的差异表达，及胰腺癌外泌体作为诊断和预后的生物标志物，外泌体是否可以用于评估胰腺癌治疗效果还需要进一步研究。另外，外泌体非编码RNA作为一种潜在生物标志物在临床应用中仍存在许多障碍，如非编码RNA稳定性问题，以及外泌体分离纯化过程复杂的问题等。

四、外泌体非编码RNA在胰腺癌治疗中的应用

外泌体可由机体绝大多数细胞合成分泌，可携带蛋白质、DNA、RNA等物质进入细胞内，同时外泌体可以促进肿瘤的发生、发展和侵袭转移等生物过程，故调控外泌体内的物质可在肿瘤治疗方面发挥较大潜力。目前关于外泌体在胰腺癌治疗中应用的研究主要分为3类：(1)肿瘤相关免疫刺激物；(2)药物载体；(3)治疗靶点。而外泌体非编码RNA在其中主要作为药物载体及治疗靶点。

有研究发现miR-506在胰腺癌组织中显著降低，其直接靶向激活STAT3-BCL2-BECN1通路可诱导胰腺癌细胞自噬凋亡，抑制胰腺癌的生长和远处转移，而将外泌体miR-506作为肿瘤治疗药物运输的载体，不但不会产生免疫排斥，而且可靶向运输至胰腺癌细胞发挥其抗肿瘤功能[30]。众所周知，吉西他滨是胰腺癌标准化疗药物，但其在胰腺癌患者中耐药率较高。有研究表明外泌体miR-146在介导胰腺癌化疗耐药中发挥重要作用。该研究发现CAFs对吉西他滨具有耐药性，CAFs在吉西他滨的作用下通过释放miR-146阳性的外泌体作用于胰腺癌细胞进而诱导化疗耐药的形成，当加入GW4869(外泌体释放抑制剂)抑制CAFs释放外泌体后，胰腺癌细胞成活率显著降低[20]。同时有研究发现miR-155表达增加，能诱导胰腺癌细胞化疗耐药的形成，获得耐药的胰腺癌细胞通过释放miR-155阳性的外泌体介导周围胰腺癌细胞化疗耐药的形成，这也为胰腺癌治疗提供了新的靶点[1]。

五、不足与期望

外泌体非编码RNA作为特殊的生物标志物应用于临床胰腺癌的诊断及治疗仍处于早期的研发阶段，在其真正投入于临床使用之前仍需解决存在的各种问题。难点之一是外泌体的提取方法，目前学术界还没有被广泛认可的统一的外泌体提取方法。其二，目前对外泌体非编码RNA的研究大多集中在表达水平的差异上，而对其分子功能的研究相对较少。其三，尚有大量的外泌体非编码RNA没有被发现，仍需更多的实验研究来证明哪些外泌体非编码RNA可作为胰腺癌的生物标志物。

综上所述，外泌体非编码RNA作为当下的研究热点，为胰腺癌的早期临床诊断及治疗提供了新的方向，外泌体非编码RNA已经成为潜在的生物标志物，为胰腺癌的治疗提供新的靶点。同时，外泌体非编码RNA将有望作为一种创伤性小并且特异度和灵敏度均较高的检测指标，在未来胰腺癌的无创诊断、治疗靶点的选择及预后的判别上发挥更大的作用。

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