微小RNA在胰腺癌诊断中的研究进展

谢雨婷 高军

海军军医大学第一附属医院消化内科，上海 200433

【提要】 微小RNA(miRNA)是由20～22个核苷酸组成的非编码单链小RNA，参与基因表达调控，其异常表达与胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移密切相关，提示miRNA有望成为胰腺癌诊断的生物标志物。

微小RNA(MicroRNA,miRNA)为真核生物核DNA编码的内源性非编码小RNA，是由20～22个核苷酸组成的单链聚合物，它们与调控细胞增殖和凋亡的靶信使RNA(messenger RNA,mRNA)的互补序列结合，主要在基因表达的转录和转录后调控中发挥致癌或抑癌的作用[1-4]。目前研究发现miRNA的抑制或上调与胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移密切相关，因此miRNA有望成为胰腺癌诊断的生物标志物。本文就其在胰腺癌诊断中的研究进展进行综述。

一、miRNA在胰腺癌中的作用机制

miRNA可以靶向数百种不同的mRNA，一种mRNA也可以成为众多miRNA的靶标[5]。miRNA通过与mRNA的3′UTR处的多个靶标结合，诱导翻译抑制或转录本降解，而这取决于miRNA分子与靶标mRNA之间的互补程度[6]。miRNA在几乎所有生物过程中都显示出广泛的调节活性，例如调节细胞生长、增殖、分化和凋亡等[7]。由于miRNA可以靶向癌症相关基因，因此可作为致癌基因，促进肿瘤细胞增殖和(或)抑制细胞凋亡，或者作为肿瘤抑制因子，抑制肿瘤的发生[8]。研究表明，乳腺癌、神经胶质母细胞瘤、肝细胞癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌中都发现了一些表达异常的miRNA的[9]，因此通过分析这些特定的miRNA有助于肿瘤的诊断，同时还可以判断肿瘤分期及患者的治疗反应和预后等[9-11]。

miR-21是研究广泛的miRNA之一，在神经胶质母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、肝细胞癌等多种类型的肿瘤中显著上调，还在肿瘤生长、侵袭和化学耐药性的关键信号通路中起作用[12]。已被证实miR-21在胰腺癌中显著上调[13-15]，并与肿瘤细胞增殖、转移以及吉西他滨耐药性有关[13,16-17]。更重要的是，在早期胰腺癌组织中即可检测到miR-21[18]。此外，胰腺肿瘤细胞可通过诱导肿瘤相关成纤维细胞表达miR-21来提高其侵袭和转移的能力[19]。

研究发现miR-148a在胰腺癌、肝细胞癌、胃癌和非小肺癌中显著低表达，与肿瘤细胞侵袭性和患者较差的存活率相关。miR-148a主要作为转移抑制因子，通过下调波形蛋白和上调E-钙黏蛋白，在上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)中发挥关键作用[20-22]。SMAD2是转化生长因子TGF-β信号转导途径中重要的肿瘤抑制基因，miR-148a通过调节SMAD2抑制TGF-β介导的EMT来抑制肿瘤转移[23]，并可抑制光甘草定治疗后的TGF-β/SMAD2信号通路来减弱肿瘤细胞自我更新、复制等特性[24]。研究报道，miR-148a在胰腺癌和胰腺上皮内瘤变组织样本中的表达均受到抑制，且在胰腺上皮内瘤变中还观察到miR-148a编码区的DNA异常高甲基化，由此推测胰腺癌细胞中miR-148a的表达受抑制可能也是由于编码区的DNA高甲基化[25]。Liffers等[26]通过胰腺癌细胞的荧光素酶报告基因分析观察到细胞分裂周期25B重组蛋白(CDC25B)是miR-148a的潜在靶标。此外，通过基于慢病毒介导的miR-148a在IMIM-PC2胰腺癌细胞系中过表达的体外模型，他们证明了miR-148a过表达对胰腺癌细胞生长潜力具有抑制作用。多项研究证明，miR-148a过表达在不同的胰腺癌模型中均产生显著的抗肿瘤活性[27-29]。

研究表明miR-217具有肿瘤抑制功能。miR-217低表达可促进肿瘤细胞运动和增殖，增强肿瘤侵袭能力[30-31]。Zhao等[32]分析了胰腺癌患者正常胰腺组织和肿瘤组织以及胰腺癌细胞系中的miRNA表达谱，与正常胰腺组织相比，miR-217在胰腺癌组织和细胞系中表达均显著下调，过表达miR-217后则可显著抑制细胞生长，且与 KRAS基因表达呈负相关。此外，对胰腺癌小鼠模型注射miR-217表达载体治疗后，观察到肿瘤体积变小，肿瘤生长受抑制，提示其具有治疗胰腺癌的潜力。

miR-23a位于致癌的miR-23a/24/27a簇中，其在胃癌中高度过表达，促进癌细胞的生长[33]。在结直肠癌干细胞的miRNA表达谱中，miR-23a表达最高，miR-23a过表达可抑制转移抑制因子1，从而促进结直肠癌细胞迁移和侵袭等[34-35]，而抑制miR-23a表达则会抑制上述病理过程。Liu等[36]报道，miR-23a在6种体外胰腺癌模型中差异性上调，miR-23a过表达与抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的凋亡蛋白酶激活因子1 表达水平降低相关联，表明了miR-23a在胰腺癌中同样具有致癌作用。

二、miRNA在胰腺癌诊断中的作用

1.胰腺组织标本中miRNA的表达：胰腺内可疑肿块的组织学评估通常需要通过对原发肿块或其转移灶进行活检，但获得的组织量少且常有炎症性改变，因此容易漏诊且良恶性疾病难以鉴别。而miRNA具有较高的稳定性，可以在极少量组织和炎症性改变的样本中被检测到。Bloomston等[37]分析了1 100多个miRNA在正常胰腺、慢性胰腺炎和胰腺癌组织中的表达，发现90%的标本中有21个高表达的miRNA和4个低表达的miRNA能正确区分胰腺癌和正常胰腺组织，15个高表达的miRNA和8个低表达的miRNA将胰腺癌与慢性胰腺炎区分开来，准确率为93.0%。Schultz等[38]在170例胰腺癌和107例壶腹腺癌组织中分析了miRNA作为诊断肿瘤生物标志物的潜在作用。他们评估了664个miRNA的表达，发现84个miRNA在胰腺癌和正常胰腺组织之间差异表达，其中胰腺癌组织中43个miRNA表达上调，41个miRNA表达下调。此外，与慢性胰腺炎相比，胰腺癌组织中17个miRNA表达上调，15个miRNA表达下调。该研究采用19个miRNA对胰腺癌和壶腹腺癌与慢性胰腺炎和正常胰腺组织进行鉴别诊断，其灵敏度为98.5%，准确率为97.0%，阳性预测值为97.8%。Xue等[39]对胰腺肿瘤切除标本中的miRNA表达进行了分析，结果显示相比于正常胰腺组织，胰腺上皮内瘤变Ⅱ～Ⅲ级及胰腺癌组织中的miR-148a、miR-217表达水平下调，miR-196表达水平显著上调。此外，他们还检测到miR-21在胰腺癌中过表达，miR-10b在胰腺上皮内瘤变Ⅱ～Ⅲ级中高表达。Yao等[40]通过公共数据集筛选出胰腺癌组织及癌旁正常胰腺组织中差异表达的基因，并对其功能和信号通路进行了富集分析，发现6个靶向间质上皮转化(mesenchymal epithelial transition，MET)因子的miRNA(miR-1-3p、miR-31-5p、miR-340-5p、miR-23b-3p、miR-34a-5p和miR-130a-3p)，其中miR-1-3p、miR-23b-3p、miR-34a-5p、miR-130a-3p具有MET的保守结合位点，可以通过PI3K/AKT信号通路靶向MET，从而影响胰腺癌的进程，提示这4个miRNA可以作为MET/PI3K/AKT途径的上游调节剂，并有望成为胰腺癌患者诊断的生物标志物和治疗靶标。

2.血清中miRNA的表达：虽然组织样本中的miRNA可能有助于诊断胰腺癌，但是对于胰腺癌的早期诊断来说，血清中miRNA的实际应用可能更为广泛。敏感、无创且易于获得的血清miRNA检测具有巨大潜力，有望成为胰腺癌患者的新型筛查方法。目前已报道与胰腺癌相关的血清miRNA主要有miRNA-18a、miRNA-16、miRNA-196a、miRNA-221、miRNA-223、miR-1290、miR-1246等，为血清miRNA作为分子标志物应用于胰腺癌的早期诊断和患者预后判断提供了参考。Morimura等[41]将36例胰腺癌患者和30名健康志愿者的血清miRNA进行了比较，结果发现胰腺癌患者血清miR-18a浓度显著高于对照组(P<0.0001)；胰腺癌患者术后血清miR-18a水平明显低于术前(P=0.0077)；原发性胰腺癌组织中miR-18a水平与血浆中的水平相当。Liu等[42]用实时荧光定量PCR技术检测了140例胰腺癌、111例慢性胰腺炎患者和68名健康对照者血清中miR-16、miR-21、miR-155、miR-210、miR-181a、miR-196a、miR-181b的水平。与慢性胰腺炎组和健康对照组相比，胰腺癌组7种miRNA的表达均显著上调。此外，miR-16、miR-196a和CA19-9三者联合应用在鉴别胰腺癌和非胰腺癌以及胰腺癌与慢性胰腺炎方面更有效。Kawaguchi等[43]比较了47例胰腺癌患者和30名健康志愿者的血清样本，发现胰腺癌患者血清miR-221水平显著高于健康者(P<0.0005)，术后血清miR-221水平显著降低(P=0.018)，且术前血清中miR-221浓度高的胰腺癌患者与肿瘤转移和不可切除性显著相关。此外，有研究比较了71例胰腺癌患者与67名健康者的血清miR-223水平，发现胰腺癌患者血清miR-223水平显著高于健康对照者(P<0.0001)[44]。Zou等[45]从129例胰腺癌患者和107名健康对照者的血清样本中提取了miR-7b-5p、miR-19a-3p、miR-19b-3p、miR-25-3p、miR-192-5p和miR-223-3p，发现这6种miRNA鉴别胰腺癌患者与健康者的灵敏度为95.3%，特异度为76.7%。Wei等[46]通过对3个独立的GEO数据集进行综合分析，选择了两个上调的miRNA(miR-1290、miR-1246)，然后在120例胰腺癌、40例胰腺良性疾病患者和40名健康对照者中进行验证。结果表明，胰腺癌患者的血清miR-1290和miR-1246表达水平升高，且在肿瘤切除后显著降低(P值<0.001)；miR-1290的AUC大于miR-1246、CA19-9(0.91比0.81、0.82)，相比于单独用CA19-9，CA19-9结合上述单个或两个miRNA更容易将胰腺癌患者与正常对照者鉴别开来。提示血清miR-1290、miR-1246或许可以成为胰腺癌诊断的生物标志物，CA19-9与miR-1290或miR-1246的联合检测可以提高诊断胰腺癌的准确率。

3.粪便中miRNA的表达：由于粪便中存在不断脱落坏死的细胞，因此粪便可能也是一种潜在的生物样本，用于检测其中的miRNA作为诊断胰腺癌的生物标志物。Link等[47]发现，与对照组相比，胰腺癌患者粪便样本中miR-196a、miR-216a、miR-143的表达水平较低。在另一项研究中，胰腺癌组粪便中miR-181b和miR-210的表达水平显著高于健康对照组[48]。Yang等[49]对30例胰腺癌、10例慢性胰腺炎患者和15名健康对照者的粪便标本进行研究，结果发现与慢性胰腺炎或健康对照者比较，胰腺癌患者miR-21和miR-155的表达水平较高，而miR-216的表达水平较低，提示粪便中的miR-21、miR-155和miR-216具有作为胰腺癌诊断标志物的潜力，但由于样本量少，有待后续进一步研究。

4.尿液中miRNA的表达：血液中含有大量的miRNA，而尿液是血液经肾小球滤过和肾小管重吸收形成的，因此尿液中也存在miRNA。此外，尿液比血液更方便采集，无创且可大量采样，便于检测。Debernardi等[50]用RT-PCR技术分析了101份尿液样本，其中包括46例处于不同疾病阶段的胰腺癌患者、29例慢性胰腺炎患者和26名健康对照者的尿液。结果发现，与健康对照者比较，miR-30e、miR-143、miR-223在I期胰腺癌患者中显著过表达(P值分别为0.022、0.035、0.040)；与Ⅱ～Ⅳ期胰腺癌患者比较，miR-143、miR-223、miR-204在Ⅰ期患者的表达更高(P值分别为0.025、0.013、0.008)；miR-223、miR-204在胰腺癌患者和慢性胰腺炎患者间的表达差异有统计学意义(P值分别为0.037、0.036)。ROC曲线分析显示，miR-143诊断Ⅰ期胰腺癌的AUC为0.862，灵敏度、特异度分别为83.3%和88.5%；miR-143和miR-30e联合诊断I期胰腺癌的AUC为0.923，灵敏度、特异度分别为83.3%和96.2%。这提示了检测尿液中miRNA有望成为诊断胰腺癌的一种无创便捷的方法。

5.胰液外泌体中miRNA的表达：胰液外泌体中包含了与肿瘤发生发展相关的蛋白质和miRNA等相关生物分子标志物，且这些外泌体中的miRNA(ex-miRs)可以免受内源性RNase活性的影响[51]。2010年Sadakar等[52]首次报道胰液中miR-21和miR-155的高表达可能是胰腺癌的潜在诊断标志物。Nakamura等[53]比较了胰腺癌患者和慢性胰腺炎患者胰液外泌体中ex-miR-21、ex-miR-155的表达，发现胰腺癌患者两者的表达显著高于慢性胰腺炎患者，两者联合诊断胰腺癌的灵敏度、特异度和准确率分别为96%、75%和91%，比胰液细胞学诊断的灵敏度、特异度和准确率高，提示ex-miR-21和ex-miR-155的表达水平有助于胰腺癌与慢性胰腺炎的鉴别诊断。

6.唾液中miRNA的表达：近年来越来越多的研究证明唾液作为一种新型的液体活检具有诊断和判断预后的价值[54]。唾液中包含了多种蛋白质、DNA、mRNA、miRNA、代谢产物和微生物群[55]。与组织和血清样本相比，唾液具有非侵入、无创伤、易于获取和存储、收集成本低等优势，此外还具有可动态监控的功能，引起患者的不适感较小[56]。Humeau等[57]从7例胰腺癌、4例胰腺炎、2例胰腺导管内乳头状黏液瘤患者和4名健康对照者唾液样本中分别提取了RNA，通过qRT-PCR筛选出94种miRNA的表达。结果显示，胰腺癌患者唾液中的miR-21、miR-23a、miR-23b、miR-29c显著上调，灵敏度分别为71.4%、85.7%、85.7%、57.0%，且具有极高的特异度(100%)；与健康对照者比较，胰腺炎患者唾液中的miR-210和miR-let-7c过度表达，灵敏度分别为100%和75%，特异度为100%和80%；与胰腺炎患者比较，胰腺癌患者唾液中的miR-216上调，灵敏度为50%，特异度为100%。提示唾液中的miRNA或许可成为诊断胰腺癌的生物标志物。

三、总结和展望

综上所述，miRNA作为一种新型的胰腺癌诊断工具，其临床应用还依然处于起步阶段，缺乏与常规诊断方法的广泛对比研究，但其具有无创、便捷、安全和相对廉价等优势。此外，miRNA还具有很强的抗降解能力，在极少量组织或体液如血清、尿液等中即可定量检测到其稳定表达，也利于该诊断技术的推广。现阶段miRNA诊断胰腺癌的基础性临床研究结果证实了其在胰腺癌诊断方面的巨大潜力，并能为胰腺癌的治疗提供新的潜在靶点。但当前相关的临床研究主要局限于较小样本量的回顾性研究，还需要大型前瞻性研究加以证实，在扩大样本量的同时比较不同方法对于胰腺癌诊断的准确率，尤其对于早期胰腺癌的诊断，最终将基于miRNA相关基因组学的胰腺癌诊疗流程在临床工作中的规范化普及。有理由相信，miRNA将为胰腺癌的早期筛查诊断带来新的曙光，未来给胰腺癌患者带来更多的临床获益。

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