循环肿瘤DNA在胰腺癌诊疗中的应用及前景

王金 蒋慧 郑建明

海军军医大学第一附属医院病理科，上海 200433

【提要】 循环肿瘤DNA(ctDNA)作为一种基于血液的生物标志物，在胰腺癌早期诊断、动态监测和预后判断等方面具有一定优势，但也存在样本前处理、提取方法等缺乏统一标准及缺少特异性标志物等难题。未来还需要要进行更大规模的临床试验和技术改进来推进ctDNA在胰腺癌诊疗中的应用。

胰腺癌是消化道常见的恶性肿瘤，在男性和女性中的死亡率分别为4.9%和4.2%[1]，并呈逐年增加趋势，这与胰腺癌早期诊断难、易转移、对当前治疗方案的敏感性较差及自身的组织学特征有关。近年来随着精准肿瘤学的快速发展，基因组图谱结果指导了越来越多癌症类型的个体化治疗。尽管高度异质的胰腺癌表现出独特的体细胞改变和特征性的驱动基因及突变，但由于胰腺解剖位置较深，组织活检及取材困难，且患者依从性低而无法进行检测[2]。与胰腺癌组织活检相比，循环肿瘤 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)作为一种非侵入性生物标志物用以揭示肿瘤特异性、个体突变及甲基化谱等遗传和表观遗传学改变，在胰腺癌的早期诊断、治疗评估、动态监测及预后评价方面显示出一定优势，因而近年来备受关注。本文就ctDNA在胰腺癌诊疗中的研究进展进行综述。

一、ctDNA 的特征

体液中的循环游离DNA(circulating free DNA，cfDNA)指在血液无细胞成分中发现的降解DNA片段。cfDNA在细胞正常状态少量分泌，在细胞损伤或坏死时分泌增加[3]。ctDNA在血液中的含量极低，仅占血液cfDNA的0.01%，长度范围为90～250 bp，比常规cfDNA片段短[4]。与肿瘤组织相比，血浆样本中肿瘤DNA的丰度相对较低，这对基于血浆的检测灵敏度提出了一定挑战[5]。ctDNA既可以由坏死或凋亡的原发性、转移及循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)释放，也可以通过正常肿瘤细胞主动分泌外泌体和前体胞外小泡等途径释放[6]。由于肿瘤相关基因突变的存在，ctDNA可以有效地与正常cfDNA区分开来。与单个肿瘤组织样本相比，ctDNA水平受肿瘤内异质性的影响较小，能够提供患者肿瘤细胞更全面的基因组信息，包括编码区和非编码区、微卫星位点、杂合缺失、突变、多态性、甲基化和拷贝数变异[7]。此外有研究发现ctDNA可以作为驱动肿瘤转移的信号分子参与肿瘤的发生和转移[8]。一项研究将鼠NIH3-T3细胞与含有KRAS基因突变ctDNA片段的大肠肿瘤患者的血浆一起温育，随后注射到小鼠体内，可以观察到小鼠大肠肿瘤的发生和转移，并在小鼠血浆中检测到KRAS基因突变ctDNA片段[8]。这表明通过监测ctDNA不仅可以监控肿瘤发生和转移，并有作为抑制肿瘤转移靶点的可能性。基于这些特征，ctDNA成为目前液体活检中常用的血源性标志物之一。

与胰腺癌组织活检相比，ctDNA测序具有明显的优势。(1)采集外周血液获得ctDNA是微创操作，可以降低患者痛苦和并发症发生率，而且不受部位的影响；(2)可以在治疗过程中的任何时候采集血液，实时和动态地监测肿瘤的分子变化，不依赖于侵入性组织活检和影像学检查；(3)通过对ctDNA的监测可以发现影像上不明显或不确定的胰腺癌组织，例如切除后残留的胰腺癌组织；(4)ctDNA可能代表了胰腺癌肿瘤的整个分子图像，可以揭示肿瘤特异性、个体突变及甲基化谱等遗传和表观遗传学改变。

与胰腺癌常见血液肿瘤标志物及液体活检指标相比，ctDNA测序具有很好的灵敏度和特异度。CA19-9作为最常见的胰腺癌肿瘤标志物，灵敏度仅为70%～89%，特异度为68%～91%[9]。有研究发现CA19-9在Lewis血型阴性表型患者容易出现假阴性，而在阻塞性黄疸患者中常表现为假阳性。此外，良性肿瘤、炎症性肿块和糖尿病患者CA19-9的水平也会增加[10]，因此目前对于CA19-9水平变化的解释及其在胰腺癌患者治疗中的作用还未达成共识。而利用二代测序技术检测ctDNA 基因突变灵敏度可以达到91%，特异度为100%[11]。CTC作为另外一种正在发展的液体活检技术，在胰腺癌的诊断和检测效果并不理想，究其原因，一方面胰腺癌具有致密的间质细胞，肿瘤细胞占比仅为30%，常常在疾病晚期才会有更多的CTC；另一方面CTC在释放后失去了原始免疫抑制微环境的保护，更容易受到免疫细胞的攻击[12]，故灵敏度低于ctDNA。

二、ctDNA的检测方法

由于ctDNA在血液中的含量低，且片段小，高度可变，因此对其检测要求较高，特别是在ctDNA含量更少的肿瘤发展早期阶段[13]。通过液体活组织检测肿瘤发生通常有两类方法，一类方法是检测原发肿瘤中已知的单个或少数肿瘤特异性突变来监测外周血液中的残留疾病，这类技术以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)为基础，包括定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)、癌症个体化深度测序分析方法(cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq)和等位基因特异性PCR(allele specific PCR，AS-PCR)等[14]。这类方法的缺点是需要关于肿瘤基因组的详细信息，但优点在于有针对性的监测可能是极其敏感的，可以在等位基因频率低至0.01%时仍具有高特异性，以较低成本快速检测到突变。第二类方法为非靶向筛选，即以第二代测序技术(next-generation sequencing，NGS)为基础，通过全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)或全外显子测序(wholeexome sequencing,WES)对全基因组范围内的拷贝数畸变或点突变进行分析[15]，并逐渐衍生出深度测序、快速测序系统(fast sequencing,FAST-SeqS)、标记扩增深度测序(tagged-amplicon deepsequencing, TAM-SeqS)、安全测序系统(safe sequencing,SAFE-SeqS)等技术[16]。这类方法的缺点是需要高浓度的ctDNA才能可靠地重建肿瘤特异的全基因组改变,但优点在于它能够识别肿瘤治疗过程中发生的新变化。

总体而言，相对于NGS，基于PCR的分析具有低成本和有效性的优势，是一种很有前景的检测胰腺癌基因突变的方法，在常规临床实践中具有可行性。NGS作为一项相对昂贵和耗时的技术，需要熟练的生物信息学专家进行分析和解释单核苷酸多态性、拷贝数畸变、插入和缺失、表观遗传学变化或组装新的基因组[17]，因此更适合于检测广泛的癌症相关基因突变。

三、ctDNA在胰腺癌诊治中的作用

近年来虽出现了较多新的胰腺癌治疗方案，但胰腺癌患者的预后情况依然严峻。新辅助化疗、代谢疗法、低氧及免疫疗法等新兴疗法的应用亟需要更精准的早期筛查、动态检测及预后评价指标作为治疗反应监测工具，以便临床医师制定更有效的个体化治疗方案。ctDNA目前在以下领域显示出一定的潜力。

1.ctDNA在胰腺癌筛查中的作用：早期胰腺癌通常在临床上没有症状，只有在肿瘤侵犯周围组织或转移到远处器官后才会出现相应的症状，临床诊断过程中超过60%的胰腺癌患者已为晚期[18]。胰腺癌基因组测序表明，基因突变到肿瘤转移至少需要15年时间[19]。全基因组和外显子组测序分析表明，胰腺癌肿瘤细胞中常见的4个起始突变基因分别为KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4[20-22]。如何用更好的筛查手段来发现这些起始基因突变，是胰腺癌临床诊疗面临的一个难题。

Zill等[23]对26例胰腺癌患者的肿瘤组织和ctDNA中的5个基因(KRAS、TP53、APC、FBXW7和SMAD4)进行前瞻性分析，在17例测序成功的患者中，90.3%(95%CI73.1%～97.5%)的肿瘤组织检测到的突变也在ctDNA中检测到，ctDNA测序诊断准确率为97.7%，5个基因的平均灵敏度为92.3%，特异度为100%，ctDNA的变化与肿瘤标志物的动态变化具有良好的相关性(r=0.93)。这项研究证明在事先不知道肿瘤基因型或ctDNA丰度的情况下，ctDNA测序在识别肿瘤衍生基因突变方面是可行、准确和灵敏的。liu等[24]利用开发的单链文库制备和基于杂交捕获测序技术(single-strand library preparation and hybrid-capture-based cfDNA sequencing，SLHC-seq)检测KRAS基因突变有效地区分了胰腺癌患者与健康对照者(AUC=0.863，95%CI0.830～0.898)，且KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4基因的组合检测对胰腺癌具有更高的诊断准确率(AUC=0.921，95%CI0.890～0.956)，灵敏度为80%，特异度为100%。此外这项研究发现显性峰值为75～85 bp突变片段在Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌患者中普遍存在，这有助于提出一种基于基因突变片段大小的早期胰腺癌检测方法。DNA甲基化发生在肿瘤发生的最早阶段，检测ctDNA的DNA甲基化有利于肿瘤早期筛查。Eissa等[25]将一种新开发的珠子甲基化技术用于胰腺癌诊断，发现分别用含Ⅰ型血小板反应蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶、锌指蛋白巴松素1以及两者联合检测ctDNA甲基化的灵敏度分别为87.2%、64.1%和97.4%，对于Ⅰ～Ⅱ期适合手术切除并具有治愈潜力的胰腺癌患者，双基因联合的灵敏度为94.8%，特异度为91.6%。目前ctDNA在早期胰腺癌患者的检出率仍然明显低于晚期患者，因此提高检出技术或采用联合蛋白标志物或多个突变位点等策略可能有助于胰腺癌的早期筛查。

2.ctDNA在胰腺癌治疗疗效监测中的作用：目前临床上胰腺癌治疗疗效的评价多通过CT、MRI、超声内镜及磁共振胰胆管成像等影像技术对术后残留肿瘤或放化疗、免疫治疗后肿瘤大小的测量来进行简单的分级。这些方法一方面不能进行动态性的检测，检测次数在短期内受到限制，另一方面灵敏度低于80%，微小病灶及转移病灶难以及时检测到。而胰腺癌的异质性及转化影响并决定着治疗手段的选择和最终的治疗效果。因此需要特异度和灵敏度更强且易于检测的肿瘤生物学指标来监测治疗效果。

一项通过KRAS突变反映晚期胰腺癌患者ctDNA检测的临床相关性研究[26]，从14例预期招募的患者在接受吉西他滨或FOLFIRINOX化疗之前和随后的每个月治疗期间分别采集血样，然后用肽-核酸钳PCR检测KRAS突变(在>90%的胰腺癌中存在)，作为ctDNA的替代标志物，并以29名健康者的血浆样本作为对照组，中位随访时间为3.7个月。结果显示10例患者化疗前采集的血浆样本中有KRAS阳性，表明了ctDNA的存在，其中9例在随访期间经历了疾病进展，同时多例患者在化疗过程中ctDNA水平发生变化，与其放射学随访数据和CA19-9水平相一致；而4例ctDNA阴性患者中只有1例经历了疾病进展(P=0.01)。治疗前ctDNA水平是无进展和总存活率的显著预测因子(P值分别为0.014和0.010)。这项初步研究支持这样一种假设，即ctDNA可以作为监测胰腺癌患者治疗效果和疾病进展的标志物。目前这项研究正在招募更多患者以证实上述发现。

3.ctDNA在评估胰腺癌患者预后中的作用：胰腺癌恶性程度高，5年生存率低于10%[27-28]，手术及放化疗等传统疗法对提高患者生存率的作用有限，目前缺乏准确的临床指标来判断胰腺癌患者的预后。

一项研究采用液滴数字聚合酶链反应检测罕见突变的肿瘤源性KRAS基因。105例在同一机构接受胰十二指肠切除术的PDAC患者中，33例(31%)血浆ctDNA阳性，患者中位生存期为13.6个月，而ctDNA阴性患者的中位生存期为27.6个月，显示ctDNA阳性患者较ctDNA阴性患者预后差(P<0.0001)[29]。这一结果表明，血浆样本中ctDNA的存在可能是PDAC患者生存不良的一个预测因子。另一项研究收集17例转移性PDAC患者，从血浆中提取ctDNA，使用NGS进行KRAS基因突变分析，并与血清CA19-9水平、影像学和生存期进行关联分析。结果显示17例患者中有5例(29.4%)检测到KRAS基因突变，且与患者较短的生存期相关，在ctDNA阳性患者中，ctDNA作为监测治疗反应的标志物与CA19-9相当，ctDNA的变化与患者生存期呈负相关[30]。这一结果表明ctDNA中突变的KRAS基因可以作为胰腺癌患者预后不良的标志物，用于评估患者生存期。

四、目前存在的难题

2016年美国食品药品监督管理局(food and drug admini-stration, FDA)批准了第1个通过分析ctDNA来检测非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突变的试验[31]。胰腺癌的相关试验标准至今还未提出。许多临床医师使用更全面但未经FDA批准的ctDNA液体活检技术诊疗胰腺癌及其他实体瘤，这些技术方案多由公司提供并用于指导应用。如何对胰腺癌患者进行ctDNA采集缺乏统一的标准，因此需要进行更多的研究来证明临床有效性和实用性。此外，在处理血液样本的技术层面上也具有很大困难，ctDNA半衰期短，保存困难，容易降解且丰度较低，样本处理方式的不同，有可能将显著的可变性引入ctDNA分析中。有研究表明采集血管的类型、处理样本所需的时间、白细胞溶解等因素会导致ctDNA被正常细胞DNA稀释进而会影响ctDNA的检测[32-33]。不同平台检测技术的灵敏度及特异度也存在较大差异。因此关于血液的ctDNA应该如何提取、处理、储存及分析，都需要大量的临床试验和数据进行验证以证实其临床实用性。未来有必要进行更大规模的前瞻性独立队列研究并推动技术改进，以验证基于ctDNA的液体活检标志物对胰腺癌患者的非侵入性诊疗作用。

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