微生物和酶技术促进烟叶醇化的研究进展

崔钰杰,邹克兴,陈义昌,刘 领,王小东,梁 伟

（1.河南科技大学农学院，河南 洛阳 471023；2.广西中烟工业有限责任公司技术中心，广西 南宁 530000）

烟草历来是我国重要的农业经济作物，其种植时间大约可追溯到16世纪末至17世纪初，相继由菲律宾传入福建，由越南传入广东，由朝鲜传入辽东。烟叶原料的采集主要包括烟叶采收、烟叶烘烤及打叶复烤等步骤，烘烤后的烟叶虽然在内部质量上得到一定的提升改善，但因烟叶的青杂气较重，对人体产生的刺激作用较大。而烟叶醇化是能改变烟叶复烤后所产生的青杂气和吸食味道过重的技术之一，微生物和酶技术是能够促进烟叶醇化进而改善烟叶品质的技术手段，其优点在于醇化效果较好、易于提取、操作简便等，具有实际的应用价值。通过对国内外有关微生物和酶技术促进烟叶醇化的相关应用研究进行综述，为缩短烟叶醇化时间和提升烟叶品质提供理论和科学依据。

1 微生物菌种在烟叶醇化中的机理研究

1.1 醇化烟叶表面微生物的菌种和菌群

烟叶中富含较多的微生物菌种和菌群，该菌群能促使烟叶中内部的化学反应。1953年，西班牙人TAMAYO 等［1］从烟叶样本中分离到芽孢杆菌（Bacillus bacteria）和球菌（Aaureus bacteria）。1972年，美国学者POUNDS 等［2］从很多烟叶样本中分离出微生物菌株，如嗜热性酵母菌以及细菌等。

国内烟草研究者对烟叶中的微生物菌种和菌群研究起步较晚。1990年，谢和等［3］以烤烟NC82为试验材料，对叶片表层微生物种类进行研究发现，烤烟表面有细菌、放线菌及霉菌。1997年，韩锦峰等［4］以未进行自然发酵、人工发酵、陈化的烤烟为试验材料，探究烟叶表面的微生物数量并对发酵阶段微生物的改变进行研究。结果表明，未发酵烤烟叶面微生物数量最多，随着自然陈化及人工发酵的进行，烤烟叶面微生物数量均逐渐减少，且出现的芽孢杆菌属以及梭状芽孢杆菌属为优势种群。2000年，邱立友等［5］对烤烟NC89、K326 和红花大金元（以下简称红大）3 个烤烟品种的烟样叶面微生物的数量、种类进行分析，发现3个品种的烤烟叶面均存在有细菌和霉菌，但没有酵母菌，红大品种烤烟叶面没有放线菌。各个烟样的叶面微生物中，细菌的数量最多且是优势微生物，而霉菌所占的比例较小，放线菌所占的比例最少。自然发酵烤烟的叶面微生物数量及种类与烤烟品种、产地、级别以及陈化时间之间有一定关系，品质越好，叶面微生物的数量越大，种类越多；同一品种的烤烟，等级高的烟叶叶面微生物的数量较大，种类也较多。2008年，杨金奎等［6］以云南烤烟品种K326 为试验材料，对不同醇化时间烟叶的表面微生物进行分离，并通过分子生物学方法对分离到的微生物的种、属分类学水平和系统发育关系进行分析。结果表明，K326 表面的细菌以芽孢杆菌属及肠杆菌属2个菌群为主，芽孢杆菌属的细菌是优势微生物类群。此外，烟叶部位等级与细菌数量也呈现明显的相关性，即在相同醇化时间的烟样中，中部烟叶样品的细菌数量高于下部烟叶，而上部烟叶样品中的细菌数量最少；细菌的种类和烟叶样品的部位等级之间没有明显的相关关系。该研究结果表明，利用可培养微生物进行分离鉴定并构建系统发育树，确定烟叶样品中微生物种群之间的系统发育关系，根据优势微生物的数量和种群研制微生物添加剂应用到烟叶中，能够快速达到烟叶醇化的目的，加速醇化进程改善烟叶品质。

1.2 微生物菌种改善烟叶品质的机制

糖与蛋白质是微生物生长发育过程中必不可少的2种物质。在微生物繁殖过程中，通过对蛋白质进行降解及对不同类型微量元素的吸收形成不同种类的氨基酸和生物酶。糖在微生物繁殖过程中经过发酵，分解成各种类型有机物及有机酸等，产生的有机物及有机酸可产生一定的香味。微生物的繁殖及代谢产生的香气物质可使烟叶内的香气成分改变，有效增加烟叶香气。赵铭钦等［7］以河南省郏县烤烟品种NC89为试验材料，对烤烟叶片中的微生物活力、酶活力、过氧化物酶活力、蛋白酶活力、α-淀粉酶活性进行测定，结果表明，在陈化过程中，烤烟烟叶中具有多酚氧化酶、过氧化物酶、蛋白酶和α-淀粉酶活性。多酚氧化酶、蛋白酶和α-淀粉酶活性在陈化初期逐渐增加，中后期逐渐降低。多酚氧化酶和过氧化酶以及增加的蛋白酶和α-淀粉酶活性可能与微生物的活性有关。由此推断微生物与酶在一起构成了烤烟烟叶的生物活性，烤烟烟叶叶面活性可能是推动烤烟自然发酵的催化剂。所以，需要适当增加微生物和酶，进而缩短醇化时间提升烟叶品质。

2 微生物在烟叶醇化中的应用

2.1 降解烟叶中有害成分

1954年，WADA 等［8］利用土壤中分离出来的假单胞细菌（Pseudomonas）中的第41小种处理烟碱溶液24 h 后，烟碱含量大幅降低，微生物数量增大，且由于pH 的降低和菌落数的增大，烟碱的分解停止。1957年，美国的FRANKENBURG 等［9］发现，烟碱的降解主要发生在晾制的初始阶段，可降解烟碱的细菌有10 个属17 种，其主要有假单胞菌、烟草假单胞菌、恶臭假单胞杆菌、纤维单胞菌、争论产碱菌等菌种。陈兴等［10］以云南烤烟烟梗为试验材料，将短小芽孢杆菌V35 菌株（Ba⁃cillus pumilusVan35）制成的菌剂用于梗丝处理。结果表明，利用V35 菌剂处理后，梗丝的总糖和还原糖均较对照有所上升，总氮含量下降，纤维素和果胶含量降低，总挥发香气物质量上升，总氮含量下降，V35 菌剂还可有效减少其杂气对呼吸道的刺激，增加梗丝香气量。薛磊等［11］以云南昆明、曲靖、保山等产地的醇化烟叶为微生物样品源，利用逐级稀释法、菌株酶活性筛选等方法对菌株产酶功能进行筛选，并对烟丝发酵样品的感官质量、香味成分、烟气有害成分释放量进行分析。结果表明，从供试云南微生物分离源样品中分离、筛选到可同时产蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的微生物菌株；将该菌株组合形成复合微生物配方喷施到烟丝上发酵，发酵后的烟丝样品细腻度有所改善，香气质和香气量均有增加，杂气减轻。马林［12］以河南灵宝烤烟B3K 为试验材料，用酶和微生物处理烟叶，并采用烟草蛋白水解法测定烟叶化学成分。结果表明，用酶和微生物处理后，烟叶中的蛋白质、烟气中有害气体、焦油生成量均有明显下降，利用酶解法和微生物发酵法能明显提高烟叶的吸食安全性。杨宗灿等［13］从河南、福建、云南3 省的复烤烟叶表面筛选出降解蛋白质能力较强的菌株，通过测定产蛋白酶活性、16S rDNA 测序、生理生化试验对其进行鉴定后，采用正交试验优化菌株在烟叶中的发酵条件，考察处理后烟叶的感官质量改善效果。结果表明，HN-3 为优选菌株，与短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）的同源性高达100%，将HN-3 菌液按照3%的烟叶质量比例施加于抽梗后的烟叶表面，在37℃条件下发酵84 h 后，烟叶中蛋白质降解率可达29.66%，短小芽孢杆菌HN-3能有效降解烟叶中的蛋白质，且能显著改善烟叶的整体感官质量。

尼古丁［1-甲基-2-（3-吡啶基）-吡咯烷］，俗名烟碱，是一种存在于茄科植物（茄属）中的生物碱，是烟草的重要成分，占烟叶干重的2%～8%［14］。尼古丁会使人产生依赖或上瘾，大量摄入尼古丁能增加心跳速率，导致血压升高并降低食欲，严重的还能引起心血管疾病、癌症、基因突变、畸形等疾病发生。生物降解法是消除降解烟叶中尼古丁含量最有效的方法。陈辰等［15］以湖南省郴州市烟草种植基地的烟草为试验材料，从样品中提取尼古丁降解菌ZUC-3，并对不同条件下的尼古丁降解特性进行研究。结果表明，ZUC-3的适宜发酵条件为温度30℃、起始pH 7.0、接种量10%、培养转速180 r/min，该条件下，尼古丁降解率可达91.53%。李天丽等［16］从醇化烟叶中分离得到可降解烟碱活性的菌群Q6，从菌群Q6 中得到1 株烟碱降解菌D1，经菌落形态、生理生态等相关性研究，将其鉴定为根癌土壤杆菌。该菌种可有效降解烟叶中的烟碱，从而达到烟叶醇化效果。这也为尼古丁的生物降解提供了新的微生物资源和技术手段。

2.2 提升烟叶品质

研究表明采用烟叶表面接种微生物的方法可提升烟叶醇化，改善烟叶品质，提升烟叶香气［17］。黄静文等［18］从烤烟叶面上分离选择获得一株短小芽孢杆菌Van35，将其制成菌剂喷施于烟丝，在45°C，60%温湿度条件下发酵21 d。结果表明，发酵后的烟丝中总糖、还原糖和钾含量升高，纤维素、蛋白质、总氮和烟碱含量均有所下降。陈兴等［19］用酪蛋白培养基和牛肉膏蛋白胨培养基对醇化烟叶上分离出的细菌进行筛选得到降解蛋白质能力较强的菌株PE1，对其蛋白酶活性的测定表明，PE1 菌株的蛋白酶活性最高，将PE1 的粗酶液用于烟丝处理，烟丝蛋白质的分解率随着处理浓度的提高而增加，烟丝的感官品质也有所改善。卫青等［20］以红花大金元烟叶品种为试验材料，从中筛选出一株产蛋白酶及多糖酶的真菌RSCT26，经分离纯化的RSCT26 进行培养，其菌落外观呈圆形，黑褐色，培养7 d直径约为5.5 cm。通过对醇化红大烟叶表面分离的产蛋白酶及多糖酶的菌株RSCT26 进行鉴定，该菌株为链格孢属（Al⁃ternaria alternata）。烟叶经RSCT26 菌剂处理后，烟膏中可溶性总糖和还原糖含量显著增加，蛋白质和总氮含量降低，再造烟叶产品经感官评吸香气量较足，烟叶青杂气和品质方面都有明显的改善。庹有朋等［21］以四川凉山云85（C3F）、2015年四川攀枝花云85（C4F）、2015年云南曲靖云85（C3F）、2015年云南楚雄云85（C2F）、2017年四川攀枝花云85（C3F）5 种烟叶等级为试验材料，分析烟叶中微生物的菌群数量和优势微生物种群，共筛选出22 株优势菌株并添加到烟叶发酵中，控制对烟叶发酵的醇化条件，对发酵醇化的烟叶进行感官评吸与分析检测。结果表明，烟叶中微生物主要以肠杆菌属、芽孢杆菌属为主，经过7 个月发酵发现，添加Enterobac⁃ter hormaechei strain C4、Enterobacter hormaechei subsp.steigerwaltii strain34998、Peanibacillus polymyxa strain HY96-2、Bacillus licheniformis strain MER TA88、Bacillus licheniformis strain POTC5 种菌株的烟叶，其香气值、香气量有明显的提升，刺激性、青杂气味得到有效控制，达到了发酵2～3年成熟发酵烟叶的效果。经理化检测，烟叶中的还原糖、总糖的含量都高于自然发酵的烟叶，植物碱与总氮都呈下降的趋势，氮碱比、糖碱比、施木克值均优于自然发酵，烟叶经发酵后向高品质发展。对发酵后烟叶进行高通量测序发现，添加的微生物成为优势主导发酵微生物，占微生物总量的30%以上，对烟叶醇化发酵过程中的物质变化起到关键作用。阮祥稳等［22］利用复合酶（纤维素酶、蛋白酶），在48℃、65%的相对湿度条件下对B3F、C3F、X3F 烟叶进行醇化。结果表明，发酵后烟叶的总氮含量与烟碱含量变化不大，总糖含量比对照样品分别提高16.8%、16.2%、11.7%，平均提高14.9%。其中上部烟叶B3F增幅最大，下部烟叶X3F增幅最小，处理后烟叶的总糖含量趋于较佳值。经酶处理后烟叶的综合评吸效果有较大提高，烟叶品质有明显改善，其中香气质变好，香气量增加，杂气和刺激性减小。

随着我国科学技术的迅速提升，技术手段和设备有了质的改变，一些烟草科研工作者尝试利用新的微生物技术融合来促进烟叶醇化的品质。李源栋等［23］在烟草根际土壤中提取得到溶杆菌（C8-1），该菌能够产生苯甲醛、榄香烯、榄香醇、α-桉叶醇。将喷施菌剂的烟丝放入恒温恒箱内发酵48 h，与对照组相比，其总糖、还原糖含量增加较大，总氮、纤维素、蛋白质、烟碱含量有所下降，糖氮比、糖碱比、氮碱比有所改善。该处理加速了烟叶发酵，提高了烟叶等级质量。张展等［24］通过微胶囊化技术，将微生物制剂和酶制剂进行包裹，形成利于微生物存活的微环境，从而利于微生物制剂及生物酶在烟叶表面较长时间内发挥作用，加速烟叶中大分子物质的降解，缩短烟叶醇化周期。刘剑锋等［25］以酿酒葡萄为原料，利用其自带的微生物及果肉中的糖分，在24～28℃下自然发酵制得天然酵母。该天然酵母在1～5℃环境中冷藏保持活性，经复苏熟成后，按5.0%～8.0%的用量施加于润叶后的烟片，叶片在相对湿度70%～80%、温度25～28℃与28～32℃环境下分两个阶段分别陈化36～40 h，即可达到烟叶醇化要求。该方法易操作、发酵快，陈化周期短。郝捷等［26］将烟草物料上料后切片使物料松散回潮；然后对烟草物料进行生物质喷洒（生物质料为蒸汽和酶制剂等体积混合的混合物），将喷洒后的烟草料物在密闭空间发酵20～150 h，温度为30～100℃，湿度为40%～100%，对完成发酵后的物料进行干燥、包装。该方法能够快速进行发酵，提高了发酵效率、简化生产工艺。马俊红等［27］在烟叶中提取一株高地芽孢杆菌J54，将该菌株制成菌剂按照烟丝重量的3%～5%进行喷施，发酵4～7 d。结果表明，高地芽孢杆菌J54可在烟叶调制或制丝过程中有效降解烟草中特有的亚硝胺（TSNAs），其降解率达5.2%～46.6%，从而改善烟叶品质。孙兰茜等［28］利用一种含蜡状芽孢杆菌的生物制剂胶囊和调制后原烟烟叶进行混合，再将烟叶进行醇化处理，在自然醇化温度下，生物制剂胶囊囊皮从固体凝胶状变化为溶胶装，内部的苯乙酸甲酯流出与烟叶表面接触，将烟叶表面的蜡质溶解，再通过囊皮内负载的角质进行分解，最终通过胶囊内的微生物对烟叶进行发酵处理，从而缩短醇化时间，提高烟叶品质。苏加坤等［29］将可增加烟丝香气和加速烟丝陈化的菌株BA-01 制成生物制剂，该生物制剂短小芽孢杆菌BA-01的活菌数达109～1011CFU/g，使用时称取0.001～0.015 g 生物制剂溶于1～10 mL 无菌水中，将其均匀喷洒于10～40 g晾晒烟丝，经喷施处理的烟叶，其香气更加充足，减少了刺激性，杂气减弱，同时缩短了陈化周期。

3 酶技术在烟叶醇化中的应用

1965年，美国菲利浦·莫里斯公司的SPANN 等［30］将烟含量约一半的烟末制成固形物稠浆，添加纤维素酶35，在室温条件下进行发酵后制成烟草薄片，然后利用低量酶、甘油及乙酸对该烟草薄片进行处理。结果表明，处理后的烟草薄片刺激程度较低，甜味重。贺兆伟等［31］采用透明圈法和发酵液果胶酶检测法从醇化烟片中筛选出1 株酶活较大的菌株TS63-9，初步鉴定为疣孢青霉（Peni⁃cillium verruculosum），该菌株产生的果胶酶在高温条件下具有较高的反应活性。杨庆等［32］以初烤烟叶为原料，研究复合酶对烟叶的醇化效果。结果表明，复合酶醇化后的烟叶，其物理构造出现改变，感官品质有一定的改善。王慧等［33］利用一种复合酶制剂来增加烟片醇厚度及香甜气。将单酶活力在1 000～40 000 U/L 的复合酶制剂在烟片发酵过程中喷洒到烟片表面，其添加量为烟片总质量的0.1%～3.0%，在烟片发酵或卷烟配方过程中于20～40℃下保持1～24 h。结果表明，复合酶制剂可对烟草中的蛋白质、纤维素、木质素及烟碱等物质进行降解，并生成氨基酸、单糖/寡糖、醇类等物质有助于提升其饱满度、香气的丰富度和层次感。纪旭东等［34］将一种黑曲霉（Aspergillusniger）所生产的葡萄糖淀粉酶应用到烟叶发酵中，其接种量为106CFU/mL。通风量为1∶1.0V/V·min，温度为30℃，时间为3 d。结果表明，与对照组相比，黑曲霉能使烟叶中总糖含量升高，淀粉含量明显降低，经过处理的烟叶其烟气柔顺、细腻度和舒适度均有提升。米其利等［35］将一种减少烟叶特有亚硝胺的复合酶制剂均匀喷施至晾晒棚内的烟叶的两面，每杆烟叶喷施100～120 mL 复合酶制剂混悬液，然后将喷施处理后的烟叶置于晾晒棚内，自然晾晒调制10～13 d。经过复合酶制剂的处理，晒黄烟调制烟叶中亚硝胺（TSNAs）含量降低26.40%～36.81%。叶亚军等［36］将具有产高酶活力中性蛋白酶的米曲霉（Asper⁃gillus oryzae）LCCC30141 按接种量为105～107CFU/g 添加到烟叶中，在温度20～40℃，湿度40%～70%条件下处理5～10 d。结果表明，添加该米曲霉能加速烟叶中蛋白质的分解，烟叶中的还原糖、硫、木质素有明显的减少，能明显缩短烟叶的发酵周期，明显改善烟叶品质。

4 小结

随着我国经济快速发展和工业制烟技术的飞速发展，醇化技术的重要性越来越受到烟草公司的广泛关注。但是根据前人研究的结果来看，大多数醇化技术都表现为菌种单一、微生物菌群之间的关联性较低。优势微生物的菌种较少、微生物制剂功能性不突出等。部分原因是由于外源生物制剂加快醇化进程的设备条件落后和烟草行业相关人才紧缺等因素的限制，使该技术或专利只停留在实验室研究阶段而未在实际生产上有大规模的应用，造成科研成果的浪费。因此，需通过各种途径对醇化技术进行优化，加快醇化新技术工业化进程的开展和落实。

当前，全球经济一体化依旧在加速进程中，国际竞争也在日益加剧。烟草产业在今后的发展过程中机会与挑战并存；既要加快烟叶醇化研究速度和深度，也要和国外先进烟叶醇化技术相互融合，对于提升我国烟叶质量以及增加国内烟草的竞争力有着不可忽视的意义。这就要求烟草科技工作者在今后研究中应充分发挥微生物和酶学技术的相互融合并将新的技术手段贯穿于烟叶醇化领域，以达到规模化生产并提高烟叶醇化效率，使再造烟叶品质质量进一步提升。创新烟叶醇化技术，将是未来烟草行业发展的主要趋势，烟叶醇化技术势在必行。