建立检测树鼩葡萄糖转运蛋白GLUT9 mRNA相对表达水平的实时荧光定量PCR方法∗

龙维虎 王陈芸 李哲丽 叶尤松 施红进 李 涛 肖 涵 唐东红∗∗

（1 中国医学科学院/北京协和医学院，医学生物学研究所 云南昆明 650118 2 云南中医药大学 云南昆明 650200）

近年来，随着生活水平的提高，营养物质丰富，食物摄入过量，血清高尿酸呈上升趋势[1]。我国高尿酸血症人群数量达1 亿多，发病年龄逐渐缩小。高尿酸血症人群主要表现为血清尿酸盐浓度过高，女性血尿酸浓度高于6.0 mg/dL，男性血尿酸浓度高于7.0 mg/dL，临床诊断为高尿酸血症[2]。血清尿酸水平的升高会增加痛风、高血压、心脏病、糖尿病的发病风险，控制血清高尿酸水平，已成为治疗代谢综合征相关疾病的有效手段[3-7]。体内尿酸的产生及代谢包括肝脏尿酸产生的调节，肾脏、小肠的重吸收及调节等复杂过程[8]，通过尿酸转运蛋白完成肾脏和小肠的尿酸分泌及重吸收，保持着血尿酸的平衡[9]。

葡萄糖转运蛋白（glucose transporters，GLUT）是将细胞外葡萄糖转运至细胞内的一个跨膜蛋白家族，参与葡萄糖代谢、免疫反应和炎症反应。到目前为止，已发现10 多种参与葡萄糖运输的蛋白质，分布在不同组织，功能也不完全相同，其中GLUT9 由SLC2A9基因编码，发挥着将尿酸转运到细胞外，维持机体血清尿酸平衡的作用[10]。研究发现，敲除SLC2A9基因的小鼠表现出尿酸浓度偏高，易发生肾结石及肾脏纤维炎症等疾病[11]。遗传学研究表明，影响尿酸的排泄原因约90%认为是基因多态性遗传缺陷使近端肾小管对尿酸盐重吸收的转运蛋白GLUT9 功能发生异常所致[12]，可见GLUT9 对调节尿酸盐水平起着重要影响。

树鼩（Tupaia belangeri chinensis）属攀鼩目，树鼩科，云南是野生树鼩主要分布区域之一，其具有生殖和发育周期短、方便饲养、进化程度高等特征，研究证明树鼩与灵长类动物具有较近的亲缘关系[13]。在神经系统、免疫系统、代谢系统等方面更适合用于人类的生物学和疾病机理研究[14]，目前与人类代谢疾病相关的机理研究主要有糖代谢、脂代谢、骨质疏松症等[15]。近年来利用树鼩作为动物模型开展高尿酸致病机理研究也有报道，肌苷作为合成尿酸的原材料，经过PNP 酶的水解作用后生成尿酸，Tang 等[16-17]和杨旭娟等[18]利用肌苷成功诱导高尿酸血症猕猴动物模型，以及利用氧嗪酸钾成功诱导树鼩的高尿酸血症。可见，树鼩也是高尿酸血症动物模型研究中一种重要的实验动物。本研究建立了实时荧光定量检测树鼩动物葡萄糖转运蛋白相关转录水平变化的方法，旨在为进一步研究高尿酸疾病的发病机制和药物治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：普通环境下（温度20～25℃，湿度40%～70%）饲养的滇西树鼩6 只，雌、雄各3 只，体重约120 g，2 周龄左右。由中国医学科学院医学生物学研究所提供，实验动物生产许可证号为SCXK（滇）K2013-0001。使用许可证号为SYXK（滇）K2013-0001。动物实验由中国医学科学院医学生物研究所动物实验伦理委员会审批，批准编号为DWS2017058，实验程序符合动物实验伦理委员会的要求，并遵守国际惯例，根据实验动物使用的3R 原则给予人文关怀。

主要试剂：逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit（Perfect Real Time）、RT-PCR 酶GoTaq®GreenMaster Mix 2、实时荧光酶SYBR Premix Ex Taq、DL2000 及DL1000 DNA marker（TaKaRa 公司）、RNA 提取液Tripure（Roche 公司）、别嘌醇（纯度≥98%，南京都莱生物）、GelRed 染料（Biotium 公司）、肌苷（Sigma 公司）。

主要仪器：高速离心机（美国Sigma 公司）、高通量组织研磨器（宁波新芝公司）、酶标仪MQX200R（Bio-tek 公司）、ND-1000 超微量核酸测定仪（美国DanoDrop 公司）、CFX 96TMReal-Time System C1000TMThermal Cycler（美国Bio-rad 公司）。

1.2 实验方法

1）引物设计与合成：引物参照人类、猕猴、小鼠目的基因SLC2A9序列设计引物：人类NM_020041.2和NM_001001290.1，猕猴XM_015137992.1，小鼠NM_001102414.1、NM_001012363.2、NM_001102415.1和 NM_145559.2。内参GAPDH参照猕猴NM_001195426.1 的核苷酸序列，利用引物设计软件Pimer Express 5.0 分别设计引物。其中SLC2A9上游引物5′-ACAATGAAGCAGGAGCGACA-3′，下游引物5′-ACTCAGGGTGATGTACGGGA-3′，产物大小210 bp；内参GAPDH，上游引物5′-AGCCCCATCACCATCTTCC-3′，下游引物5′-AATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′，产物大小121 bp；大连宝生物工程有限公司合成。

2）组织取样及总RNA 提取：用2.5%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射树鼩，安乐处死动物，迅速采集新鲜肾脏约100 mg，加入1 mL Tripure，加入适合大小的钢珠，放入高速组织研磨器中彻底研磨；放入1.5 mL EP 管中静置5 min，加入氯仿200 μL 充分涡旋，静置15 min；12 000 r/min 离心25 min 后取450 μL 上清液于EP 管中，加450 μL异丙醇，混匀后静置10 min 后离心；管内壁稍干后加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，离心弃上清液，加入30 μL DEPC 水溶解，水浴10 min。取总RNA 样品1 μL，测量浓度后，加入DEPC 水稀释。

3）RNA 完整性检测：将上述所提取的总RNA样品各2 μL，经琼脂糖凝胶电泳后观察5S、18S 和28S 条带，再取1 μL 于ND-1000 超微量核酸测定仪测定RNA 浓度。

4）RNA 逆转录：按照逆转录试剂盒说明操作，分别加入0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix、2 μL 5×PrimeScript Buffer、0.5 μL Random 6 mers、0.5 μL Oligo dT Primer、1 μL RNA（1 000 ng/μL）、RNase Free dd H2O 5.5 μL，总体积10 μL。程序设置为：37℃15 min，85℃5 s，4℃10 min 条件下获得cDNA。

5）建立SLC2A9及GAPDHmRNA 实时荧光定量PCR 反应熔解曲线及标准曲线：以Esidilution梯度稀释逆转录合成的树鼩cDNA 第1 链，分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4倍浓度，以原始cDNA第1 链及稀释后的cDNA 为模板，各做2 个平行样进行实时荧光定量检测。目的基因和内参基因反应体系如下：1 μL cDNA 模板，各1 μL 的上、下游引物，9.5 μL 去离子水，12.5 μL Taq II 酶；反应条件：94℃30 s，94℃5 s、60℃30 s，35 个循环，获得Ct值，建立SLC2A9及内参GAPDH的相关熔解曲线及标准曲线、斜率及R2值、扩增效率。

6）PCR 产物测序验证：SLC2A9及GAPDH的PCR 扩增产物分别通过昆明铂尚生物公司测序，测序所得到的核苷酸序列通过DNAMAN 软件与NCBI 所报道的人类的SLC2A9mRNA 的核苷酸片段序列（NM_020041.2）及GAPDHmRNA 的核苷酸片段序列（NM_001289745.3）进行同源性比对。

7）肌苷致树鼩高尿酸血症动物模型树鼩肾脏组织中SLC2A9mRNA 相对表达量变化检测：选取6 只空腹树鼩，每组2 只分3 组。第1 组腹腔注射300 mg/kg 肌苷（inosine）和30 mg/kg 别嘌醇（allopurinol，ALLO）、第2 组腹腔注射300 mg/kg肌苷、第3 组0.9%的生理盐水。注射1 h 后安乐处死实验动物，取肾脏组织100 mg，加入1 mL Tripure 后提取RNA 逆转录为cDNA，用cDNA 的第1 条链作为模板，每个检测样品做复孔。CFX Manager 软件处理分析结果，得到对应的Ct值，以样品Ct值，通过软件分析获得ΔΔCt值，得到组织中SLC2A9mRNA 表达量变化。

2 结果

2.1 RNA 纯度和完整性 树鼩总RNA 样品经琼脂糖凝胶电泳，观察到3 条带亮度如图1所示。说明提取的RNA 没有发生降解，经ND-1000 超微量核酸测定仪测定结果显示A260/A280位于1.8～2.0之间，可用于后续实验。

图1 树鼩组织总RNA 凝胶电泳

2.2 目的基因SLC2A9和内参GAPDHPCR 产物测序及序列比对 将目的基因及内参基因PCR扩增产物送至昆明铂尚生物公司测序后，用DNAMAN软件分别对与NCBI 报道的人类SLC2A9（NM_020041.2）和GAPDH（NM_001289745.3）核苷酸片段序列的同源性进行比对（图2、图3），结果显示树鼩肾脏组织中扩增出的SLC2A9mRNA 的核苷酸片段序列与人类的同源性为81%，GAPDHmRNA 的核苷酸片段序列与人类的同源性为95.1%。进一步说明扩增出的目的片段为树鼩的GAPDH的核苷酸片段及SLC2A9mRNA 核苷酸片段。

图2 树鼩目的片段SLC2A9核苷酸序列与人类核苷酸序列比对图

图3 树鼩GAPDH 的核苷酸序列与人类核苷酸序列比对图

2.3 树鼩肾脏组织SLC2A9和GAPDHmRNA实时荧光定量PCR 熔解曲线和标准曲线 通过进行实时荧光定量PCR 反应，绘制出树鼩肾脏组织SLC2A9mRNA 和GAPDHmRNA 实时荧光定量PCR 熔解曲线和扩增曲线（图4），显示树鼩SLC2A9mRNA 和GAPDHmRNA 实时荧光定量PCR 反应熔解曲线单峰，特异性好。根据Ct值，CFX Manager 软件制作出GAPDHmRNA 和SLC2A9mRNA 扩增曲线及标准曲线（图5），GAPDHmRNA 扩增效率为125.4%，斜率为-2.833，R2=0.997；SLC2A9mRNA 扩增效率达到107.7%，斜率为-3.151，R2=0.996。

图4 SLC2A9（a）和GAPDH（b）mRNA 实时荧光定量PCR 反应扩增曲线和熔解曲线

图5 GAPDH（a、b）和SLC2A9（c、d）mRNA 实时荧光定量PCR 反应的扩增曲线及标准曲线

2.4 肌苷所致的高尿酸血症树鼩SLC2A9mRNA表达水平的变化 树鼩被安乐死后，从其新鲜的肾脏组织中提取RNA，经实时荧光定量PCR 检测，以GAPDH为内参基因，SLC2A9mRNA 相对表达变化如图6所示。在肾脏组织中，肌苷组相对于对照组的表达显著上调，肌苷加别嘌醇组相对于对照组表达显著下调，说明所建立的方法能灵敏地检测树鼩高尿酸动物模型SLC2A9mRNA 表达水平的变化。

图6 树鼩肾脏组织SLC2A9 mRNA 相对表达变化

3 讨论

树鼩作为一种近年来开发的实验动物，NCBI未能检索到树鼩SLC2A9mRNA 的核苷酸序列。本实验通过参考NCBI 数据库的人、小鼠、猕猴核苷酸序列，设计引物，合适的退火温度，筛选扩增效果较好的引物。序列比对分析了所获得的内参GAPDH片段及SLC2A9片段，发现与人类的核苷酸片段序列同源性高达80%以上，说明所扩增的基因片段分别为内参基因GAPDH核苷酸片段及目的基因SLC2A9核苷酸片段。同时可见SLC2A9及GAPDH实时荧光定量PCR 扩增特异性较好，熔解曲线为单峰，无杂峰。为保证荧光定量技术分析结果的可信度，以10 倍为稀释因子稀释不同浓度梯度的cDNA，得到目的基因及内参基因表达的标准曲线。扩增效率分别为107.7%和125.4%，R2分别为0.996 和0.997，达到荧光定量要求[19]。说明本研究所建立的实时荧光定量PCR方法可应用于定量检测树鼩葡萄糖转运蛋白GLUT9 mRNA 转录水平。

肌苷，也称次黄嘌呤核苷，常用于诱导高尿酸动物模型的药物[20]。本实验采用腹腔注射300 mg/kg 肌苷构建急性高尿酸树鼩模型，利用建立的实时荧光定量PCR 方法对高尿酸血症树鼩进行SLC2A9mRNA 相对表达量检测，结果显示肌苷给药组相对于其他组别表达量显著上调，与实验预期相符。本实验利用实时荧光定量PCR 方法对树鼩SLC2A9mRNA 转录水平的变化实现定量检测，稳定重复性高、可操作性强等优点。虽然树鼩数量来源有限，但实验数据和结果仍具有一定的参考性，建立的检测树鼩葡萄糖转运蛋白GLUT9 mRNA 相对表达水平的实时荧光定量方法可应用于高尿酸血症的发病机理、新药研究等方面的研究。