高分子材料生物降解性检测方法研究进展

黄开胜，赵 彦，张锡辉，丁琪琪,，徐董育

(1. 深圳市计量质量检测研究院，广东 深圳 518000; 2. 清华大学 深圳国际研究生院环境与生态研究院，北京 100084)

0 引 言

塑料因其良好的机械性能、可加工性、耐用且价格低廉等优点，被广泛用于人们的日常生活中。作为全球最大的塑料生产国与消费国，我国塑料制品年产量逐年递增，塑料表观消费量于2019年突破1.26亿吨[1]。由于分子量大且结构中含有大型取代基团，塑料很难被微生物通过脂肪酸氧化反应降解，导致塑料使用量的增加伴随着固体废物和塑料垃圾的快速累积，最终引起白色污染问题。据统计，全球海洋里现有将近5.25万亿吨的塑料碎片，其中92%为微型塑料。这些碎片可作为载体吸附大量污染物并富集在海洋动物的体内，最终通过食物链回到人类身上[2-3]。海洋中塑料微珠的发现加剧了人们对塑料污染的关注[4]。在2015年的联合国环境大会上，微塑料污染与气候变化、臭氧耗竭和海洋酸化并列为重大全球污染问题。全球现有100多个国家和地区提出了“限塑”和“禁塑”相关政策。我国国家发改委和生态环境部于2020年1月发布了《关于进一步加强塑料污染治理的意见》，首次将塑料污染治理上升到国家层面。同年7月，国家发展改革委、生态环境部、工业和信息化部等九部门联合印发《关于扎实推进塑料污染治理工作的通知》，为做好塑料污染治理工作，明确阶段性任务部署。

值得注意的是，关于塑料垃圾的处理早有研究，不同国家地区采取的处理方式较为相似。首先，从源头上减少对塑料制品的使用以降低废弃物的产生量，其次提倡塑料制品重复使用和回收再利用，最后优化废物的处理方式（如图1[5-6]所示）。然而，由于塑料制品种类多且用途广，尤其是塑料包装、购物袋和餐具等一次性塑料制品，较难实现统一管理，常被任意遗弃或从垃圾循环处理系统中泄露到环境中去。因此，塑料废弃物回收成本高且再利用价值低，目前仅有10%左右的塑料垃圾被循环再利用，大部分的塑料废弃物依然是通过焚烧或填埋处理[7]。生物降解材料的出现为规避这类环境污染问题提供了一种有效手段。

图1 塑料废物处理策略

生物降解材料是指在自然界如土壤、沙土等条件下，或特定条件如堆肥、厌氧消化或水性培养液等条件下，能被微生物作用降解，并最终完全降解变成二氧化碳（CO2）或/和甲烷（CH4）、水（H2O）及其所含元素的矿化无机盐以及新的生物质的材料。中国塑料加工工业协会秘书长马占峰等人指出，政策导向为生物降解材料提供了广阔的市场空间，塑料加工行业将继续推进绿色可持续发展的生态化建设目标，生物降解塑料及产品的需求将呈爆发式增长[1]。然而，目前生物降解材料产能过低，无法满足市场需求。相比于传统塑料，生物降解塑料的成本较高。这导致市面上的降解塑料材料鱼目混珠，伪降解塑料制品层出不穷，真假难辨。因此，塑料制品的生物降解性检测对于市场监管至关重要，本文罗列了一些常见的生物降解材料，并对现有的生物降解性检测方法进行归纳整理，分析其优缺点，提出相应的改进意见。

1 常见生物降解材料

生物降解材料需要微生物能够对其所有有机成分进行消化代谢。一般来讲，生物降解涉及几个关键步骤（如图2[8]所示），分别是微生物在材料表面定植，微生物分泌胞外酶，胞外酶将聚合物降解为低分子量化合物，微生物消化代谢低分子量化合物使其转化为自身生物质或以CO2的形式释放。

图2 聚合物生物降解过程的关键步骤

生物基顶尖研究机构nova-Institute最近发布的报告显示，全球生物塑料产能增长迅猛，将从2018年的211万吨左右增长到2023年的262万吨[9]。天然多糖类聚合物如纤维素衍生物、热塑性淀粉(TPS)及其混合物，凭借其价格低廉，来源广泛易得的优势，正在逐渐取代传统塑料应用于柔性薄膜包装领域[10-11]。聚乳酸(PLA)是目前学术界和工业界研究最为广泛，产业化成熟度较高的一种生物降解材料，具有无毒无刺激、强度高、良好的生物相容性和可加工性等优点，有望替代聚苯乙烯(PS)和聚丙烯(PP)应用于包装领域[12-13]。聚羟基脂肪酸酯（PHA）是一种天然高分子生物材料，可由多种微生物合成，具有优良的生物相容性、生物可降解性和塑料热加工性能，可作为生物医用材料和生物可降解包装材料。据统计，PHA树脂相关的国际专利数量仅次于PLA树脂[14]。聚己二酸-对苯二甲酸丁二酯(PBAT)是己二酸丁二醇酯和对苯二甲酸丁二醇酯的共聚物，具有优良的延展性、耐热性、抗冲击性和断裂伸长率等[15]。值得注意的是，PBAT的生物降解性一直备受争议，直至2018年Michael等提出使用13C标记聚合物，并利用纳米级二次离子质谱(NanoSIMS)跟踪分析13C从可生物降解聚合物到二氧化碳和微生物生物量的整个转化过程，明确证实PBAT的每个单体单元的碳均可被土壤微生物(包括丝状真菌)利用来获取能量并形成生物量[16]。PBAT是由BA链段（脂肪族链）和BT链段（芳香族链）聚合而成的半晶状共聚酯。研究表明，相比于芳香族域(BT链段)和结晶区，脂肪族域(BA链段)和无定形区域更容易水解和生物降解[17]。聚丁二酸丁二醇酯(PBS)是由丁二酸和丁二醇经聚合而得的典型的可生物降解材料，用途极其广泛，可用于包装、餐具、化妆品瓶及药品瓶、一次性医疗用品、农用薄膜、农药及化肥缓释材料、生物医用高分子材料等领域。最新报告显示，PHA的年产量约为25 320吨，占全球生物塑料产量的1.2%，PBAT和PBS的产量分别占比13.4%和4.3%[9]。聚己内酯（PCL）是由ε-己内酯单体在特定金属催化剂的催化条件下开环聚合而成，可通过改变聚合反应条件来控制其分子量，具有良好的生物相容性及生物降解性等，被广泛应用于药物载体、可降解塑料、纳米纤维材料等领域。表1罗列了一些常见的生物降解材料及其特点和应用。

表1 常见生物降解材料

2 生物降解性检测方法

目前，关于生物降解性检测方法的研究有很多，大体可分为三类，即好氧微生物降解、厌氧微生物降解和其他检测方法。

2.1 好氧微生物降解检测方法

好氧微生物降解是指微生物以样品中的有机物作为碳源，在有氧的条件下进行好氧代谢，经过一系列生化反应转化为二氧化碳、水和生物质的过程。依据降解环境不同，好氧微生物降解检测方法可分为土壤有氧环境、淡水有氧环境、海水有氧环境和堆肥环境。

2.1.1 土壤有氧环境

土壤有氧环境降解检测方法是将薄膜状或其他形状的样品埋置于土壤中，在一定温度湿度条件下，样品受热、氧、水和微生物等因素作用而发生降解，通过定期测试样品的力学性能变化、分子量变化以及质量损失等来评估其生物降解性能的测试方法。翁云宣等[27]将聚乳酸（PLA）和聚己二酸丁二酯-对苯二甲酸丁二酯（PBAT）按40∶60的比例混合并浇铸成膜，对比研究PLA、PBAT和PBAT/PLA 薄膜样品在土壤环境中的降解过程。通过使用SEM、DSC、TGA、IR和元素分析仪等手段对降解过程中的样品进行分析，作者发现在PBAT、PLA和PBAT/PLA样品的分子结构中，碳原子含量降低，氧原子含量增加。降解前后，PBAT/PLA共混物中各组分的熔点变化与各自单体聚合物的熔点变化基本一致，但共混体系中的PBAT和PLA的生物降解率与单一材料的生物降解率不同。在模拟农用地膜的使用环境下，Rudnik等[28]通过采用不同的暴露方法，对比研究了聚乳酸（PLA）和聚羟基烷酸酯（PHA）在土壤中的生物降解行为。结果表明，PHA比PLA更适合用作农业地膜的原材料。

土壤有氧环境下的检测标准有ISO 11266、ISO 17556（即 GB/T 22047）和 ASTM 5988等。ISO 11266主要测定各种有机组分，ISO 17556（即GB/T 22047）主要测定材料的生物分解能力。在GB/T 22047中规定，在平稳阶段或试验周期（6个月）结束时，参比材料的生物分解百分率需超过60%，且两个空白试验烧瓶的生物需氧量（BOD值）或二氧化碳释放量的相对偏差不超过20%，试样结果方为有效。土壤有氧环境是模拟自然界土埋法而开展的生物降解性能检测方法，具有很高的实际应用价值。然而，材料的降解效果与土壤性能指标（如土壤组分、微生物种类等）密切相关。由于受气候、植被等因素的影响，各个地区很难采用统一的试验土壤，导致土壤有氧环境的降解结果重现性较差[29-30]。而且，在降解过程中，很难完全收集塑料制品裂解产生的小碎片，因此，通过质量损失评估材料生物降解性存在缺陷。

2.1.2 淡水有氧环境

淡水有氧环境降解检测方法是将实验材料作为好气微生物的唯一碳源，通过测定好氧微生物在水性系统中生长繁殖所消耗的氧气量或释放的二氧化碳量来评估材料的生物降解性能。生物分解率是生化需氧量（BOD）和理论需氧量（ThOD）的百分比或释放的二氧化碳量和二氧化碳理论释放量（ThCO2）的百分比。

淡水有氧环境下的检测标准有ISO 14851（即GB/T 19276.1）、ISO 14852（即 GB/T 19276.2）、ASTM D5209、JIS K6951、ISO 9439、ISO 14593、OECD 301 A&F和EN 14047等。GB/T 19276.1和GB/T 19276.2是在好氧环境中进行测试，前者通过测定密闭呼吸计中的需氧量来评估材料的分解能力，后者通过测定释放的二氧化碳亮来倒推材料的生物分解能力。在试验周期（不超过6个月）结束时，空白烧瓶的BOD或二氧化碳释放量不得超过经验值的上限（这个值与接种物的数量相关）。由于降解反应在水介质中进行，微生物与试样接触均匀，所以此方法的重复性较好，可反映自然界淡水系统中材料的生物降解情况。适用于单一聚合物、水溶性聚合物、共聚物和含有添加剂的塑料材料等；但是，仅通过测定材料生物分解过程中的气体释放量来评估材料的生物降解率，无法观察试样本身的形态变化，水介质与试样的吸附作用、试样的形状、试样组分中含有的低分子物质或添加剂等都会对降解结果产生影响。

2.1.3 海水有氧环境

塑料垃圾对海洋环境的污染日益严重，每年有数百万吨塑料垃圾在海洋中堆积，对生态系统、公众健康和经济造成多重危害。受潮汐、洋流和海洋褶皱影响，密度较大的生物降解材料可能下沉到亚海岸并到达海底表面。从海水表面至深海层，沉积物状态从有氧到缺氧再到厌氧，呈现出急剧变化的氧梯度。在实验室条件下，模拟海洋中不同海水沉沙区域栖息环境（如在海洋科学中被称为亚滨海区的阳光可照射到的底栖带），可通过测量塑料材料在接触海洋沉积物时的CO2逸出量，来评价塑料材料的生物降解性能。依据国际标准ISO 19679(2016) 测定海岸带海水-沉积物界面中非浮动塑料材料的好氧生物降解的试验方法，Briassoulis等[31]在实验室模拟条件下对4种塑料材料（包括LDPE、PHB、PBSeT和PBSe）进行生物降解性能评价并对该标准提出了改进意见。研究发现，在生物反应器中搅动海水表面可以提高海水-沉积物界面上氧气的持续可用性（如图3所示），从而在模拟真实的滨海环境的整个测试过程中保证好氧生物降解条件。

图3 (a) 模拟海水降解反应器；(b) 用于搅动海水表面的磁力搅拌子

海水有氧环境下的检测标准有ISO 18830、ISO 19679和ISO 22404。禁限塑令的实施起源于海水中塑料微珠的发现，因此，从根本上来看，在海水环境下评估塑料材料的生物降解性更具有实际意义。但是，海水本身的高盐度使得其微生物浓度及丰富度较低，存在检测周期长（一般为两年）的问题，不适合作为市场监管的检测方法。

2.1.4 堆肥环境

20世纪80年代以前，堆肥很少被用于处理固体废物（欧洲为4%，美国更少）[32]。直到1994年，欧盟成员国发布的《包装及包装废弃物指令》中明确规定堆肥法可作为处理包装废物的一种途径。随后，通过控制反应湿度、温度、pH和停留时间等重要参数，使用堆肥法处理固体废物的研究逐渐增多。在实验室模拟测试条件下，细菌，真菌、霉菌和放线菌均可作为活性微生物用于降解实验[6]。为了研究聚羟基脂肪酸酯（PHAs）的化学结构对其生物降解性的影响，翁云宣等[33]依据ISO 14855-1，对比研究了聚羟基丁酸酯 (PHB)，PHBV(40%HV)，PHBV(20%HV)，PHBV(3%HV)和 P(3HB,4HB) (10 %mol 4HB)在受控堆肥条件下的生物降解行为。结果表明，PHAs的生物降解速率受其化学结构的影响，5种材料的生物降解速率由大到小依次为P(3HB,4HB) (40%mol 4HB)，PHBV(40%mol HV)，PHBV(20%mol HV)，PHBV(3%mol HV)，PHB。

工业残留物、城市固体废物和农业废物中的木质纤维素累积量逐年递增。木质纤维素材料的降解主要受到两大技术瓶颈的阻碍，即木质纤维素的难降解性和缺乏高效的木质纤维素嗜热分解微生物[34]。Wang等[35]通过利用原子力显微镜（AFM）、X射线光电子能谱（XPS）和13C核磁共振能谱（13C NMR）等技术，观察了木质纤维素在堆肥条件下降解过程中的成分和结构变化。结果表明，降解后的木质纤维素总碳含量较初始含量降低了27.7%，总氮含量由1.1%增加到1.8%。水溶性碳、水溶性氮和水解酶活性在3～14 d之间波动较大，此为堆肥过程的活跃期。通过对XPS谱图分析发现，可降解碳组分主要为C1（含C-H或C-C键），与初始量相比降低了25.5%。核磁共振结果（图4）显示，共振信号以氧烷基碳为主（76.6%～83.1%），烷基碳在8.1%～10.2%之间波动，进一步证实了木质纤维素的有效降解。

图4 木质纤维素中在降解周期0、7、14和28天的13C NMR图谱和RNMR-C/Ash值

堆肥环境下的检测标准有ISO 14855（即GB/T 19277）、ASTM D5338、EN 14046、JIS K6953、ISO 14855和AS 5810等。ISO 14855是评价塑料制品生物降解性的最常用的堆肥方法。ISO 14855描述了一种标准的堆肥试验，该试验基于在好氧条件下通过测量CO2释放量来评价材料的生物降解性能。在ISO 14855中，为了论证聚合物材料的生物降解指标和保证材料在180天内能达到最大降解程度，接种和测试参数都尽量设置到最优条件。然而，有研究表明，通过测定CO2释放量来计算试样材料的生物降解率的方法并不一定准确。CO2释放量与聚合物分子量的减少、力学性能和化学结构的变化不直接相关，CO2的产生可能来源于添加剂，着色剂等其他物质，而非聚合物树脂本身[32]。此外，由于堆肥中微生物的种类受其储存条件（如温度、湿度等）的影响，通过使用在不同时间和温度下储存的堆肥，Yang等人对比研究了不同时间和温度下储存的堆肥对纤维素、聚己内酯（PCL）和聚丁二酸丁酯（PBS）生物降解过程的影响[36]。结果发现，该实验过程中纤维素的降解几乎不受堆肥的贮藏时间和温度影响，而PCL和PBS的生物降解性与贮藏条件密切相关。这表明纤维素可能并不总是适合作为评估样品生物降解性能的参比样本。

2.2 厌氧微生物降解检测方法

厌氧微生物降解是指微生物在厌氧条件下，对样品中的有机物进行厌氧消化代谢，转化为甲烷、二氧化碳和生物质的过程。依据降解环境不同，厌氧微生物降解检测方法可分为水性培养液厌氧环境、活性污泥厌氧环境和高固态厌氧环境。

2.2.1 水性培养液厌氧环境

水性培养液厌氧环境降解检测方法是在水性培养液中以洗涤并稀释后的消化污泥（含极少量无机碳且总干固体浓度在1～3 g/L）为厌氧菌源，通过测定样品在密闭条件下厌氧消化降解为二氧化碳和甲烷的产生量来评估样品生物降解性能的方法。

水性培养液厌氧环境下的检测标准有ISO 14853（即GB/T 32106）。与淡水有氧环境一样，由于降解反应在水介质中进行，微生物与试样接触均匀，所以此方法重复性较好。相比于有氧环境，厌氧环境具有检测周期短、能耗低等优点，但厌氧菌在降解前需要进行孵化，并且对温度和有害物质更加敏感，一旦失活，恢复周期较长。

2.2.2 活性污泥厌氧环境

活性污泥法是一种以活性污泥为接种物的生物处理技术，活性污泥法的降解效率与污泥数量和质量息息相关。Belone et al.设计了以十二烷基硫酸钠和过氧化氢为原料的净化污泥三步法，研究7种聚合物（LLDPE、HDPE、PP、PS、PET、PA66和SBR）在活性污泥厌氧消化过程中的质量、表面特征、力学性能、热性能和官能团等方面的变化（图5）[37]。结果表明，LLDPE、HDPE、PP、PS和PET在活性污泥处理过程中没有明显的降解。由于增塑剂和填料的水解氧化，PA66和SBR的完整性遭到破坏，抗拉强度均下降了约50%～60%。

图5 HDPE, PA66和SBR降解前后的扫描电子显微镜图谱

活性污泥厌氧环境下的检测标准有ISO 13975（GB/T 38737）、ASTM D5210、ISO 11734和OCED 311等。其中，GB/T 38737是模拟活性污泥消化系统，接种物取自污泥污水消化池或牲畜粪便垃圾消化池等。通过测定试样材料降解过程中的生物气体（二氧化碳和甲烷）释放量，来评估试样材料的生物降解性。需要注意的是，污泥是一种难以管理的废弃物，含有高浓度的有机物和病原微生物[38]。而且厌氧消化降解过程中会产生易燃和有毒气体，如甲烷、硫化氢和氨气等。目前，关于活性污泥法的研究主要集中在可生物降解材料（如PHA、PHB等）的生产方面[39-40]。

2.2.3 高固态厌氧环境

高固态厌氧消化降解是一种在固体含量很高的条件下进行厌氧发酵并产生沼气的有机固体废物处理方法。高固态厌氧消化降解过程一般分为三个阶段，即液化阶段、产酸阶段和产甲烷阶段，主要由产生挥发性脂肪酸的微生物（acidogens）和消耗挥发性脂肪酸产生甲烷的微生物（acetogens和methanogens）两大功能类微生物参与[41]。相比于产甲烷微生物，产脂肪酸微生物的生长速度更快，导致脂肪酸无法及时被转化为甲烷，体系pH值下降，进而抑制产甲烷微生物的繁殖，降低厌氧消化降解效率。因此，整个降解周期需定期添加碱液使体系pH值控制在适宜范围内。

高固态厌氧环境下的检测标准有ISO 15985（即GB/T 33797）和ASTM D5511等。其中，GB/T 33797方法是模拟最佳高固体含量（总干固体大于20%）厌氧消化环境，以厌氧消化处理后的家庭垃圾为接种物，通过测定试样材料降解过程中的生物气体（二氧化碳和甲烷）释放量，来评估试样材料的生物降解性。试验周期一般为15天，如果生物分解现象依然明显，可延长至生物分解平稳期。高固态厌氧消化降解具有效率高，出料量少和废弃物资源化等优点。但是，由于其体系均一度和传质效果较差的问题，物料在降解过程中的代谢产物易局部累积而对厌氧消化活性产生抑制作用。此外，影响固态厌氧消化过程的因素很多，如物料的负荷量、氨氮浓度、预处理方式（物理、化学和生物预处理）、消化工艺、总固体含量、微生物种类、多样性和丰富度等[42]。代谢过程产生的挥发性脂肪酸（VFA）和氨氮浓度是抑制固体厌氧消化过程的主要内源性因素。

2.3 其他检测方法

研究人员也会通过视觉观察样品在微生物环境中的形态变化，测定样品酶解前后的质量损失、分子量分布、结晶度和机械性能等来评估样品的生物降解性。

2.3.1 特定微生物侵蚀法

特定微生物侵蚀法就是以微生物对塑料的侵蚀程度作为评价塑料可生物降解性能的参考依据。该方法通过将试样置于接种有特定微生物且无有机碳的固体琼脂培养基中，在一定温度湿度条件下培养4周以后，观察试样表面微生物生长状况、试样质量损失等性能变化来定性评价试样的生物降解性能。假单胞菌是从土壤中分离出来的一种能够降解各种类型塑料的生物降解微生物。Li Jiaojie等[7]利用从超级蠕虫肠道中提取的假单胞菌对聚苯硫醚(PPS)进行降解研究（如图6所示），提出了可用于比较和验证不同类型塑料在10天这一短反应时间内的生物降解效率的筛选系统新思路。与之相关的标准有ISO 846—1997 塑料-微生物作用的评价。此方法操作简单，重复性高，常用于快速评价材料的生物降解可能性，但无法给出材料的最终生物降解率。

图6 特定微生物侵蚀法的操作过程示意图

2.3.2 环境微生物试验法

环境微生物试验法是利用环境（如土壤、河水等）中的常见微生物，在实验室条件下，将高分子材料试样浸没在含有环境微生物培养基中，通过测定材料质量损失、利用气体吸收装置收集材料在降解过程中释放的各类气体（如CO2、CH4等）、目测或显微镜观察菌落生长情况等分析方法，来评估材料的生物降解性能[43]。环境微生物试验法的降解机理有两种，一种是微生物将酶释放到周围介质，酶与底物接触发生降解反应；另一种是底物必须与微生物细胞紧密接触，酶解反应发生在微生物细胞表面。此方法的数据重现性较好，但是降解周期与培养基的成分、培养条件等密切相关。

2.3.3 酶催化降解实验

酶催化降解实验是实验室条件下常用的一种快速评价高分子材料生物降解性的方法。与非生物催化剂相比，酶具有一些显著特点，即高效性、专一性、温和性和可调控性。鉴于黑曲霉、皱纹假丝酵母、枯草芽孢杆菌和假单胞菌均已被证明对聚氨酯类具有生物降解活性，Natasha等[44]以牛血清白蛋白（BSA）为阴性对照，选用黑曲霉脂肪酶、皱纹假丝酵母脂肪酶、枯草芽孢杆菌酯酶和假单胞菌胆固醇酯酶4种商用酶对聚氨酯泡沫颗粒进行酶解处理，并用气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法鉴定聚氨酯降解产物。结果显示，聚氨酯泡沫颗粒在这4种酯酶的作用下均可降解，其中假单胞菌属的胆固醇酯酶对聚氨酯泡沫颗粒的酶解效果最好，在24 h内产生的降解产物（二醇和二酸）量最高。

3 结束语

对高分子材料的生物降解性测试方法可归纳总结为两种试验方法，即筛选试验（如酶解、水解试验等）和模拟现实条件试验（如土埋法、堆肥法等）。塑料材料的生物降解性能取决于塑料树脂类型、尺寸大小、降解环境和降解时间等多个因素。其中，塑料树脂类型直接决定该材料分子结构是否能被微生物消化降解。目前，评估生物降解材料的检测方法标准很多，最常用的是GB/T 19277.1—2011《受控堆肥条件下材料最终需氧生物分解能力的测定采用测定释放的二氧化碳的方法 第1部分：通用方法》。然而，此方法存在降解周期长、操作繁琐、过程难控制、数据重复性差和检测成本高昂等问题。现有的生物降解材料快速检测方法，仅仅是通过化学分离和仪器分析的方法对材料各组分进行定性定量分析，并不能直接评估材料的生物降解性能。相比于纯品材料，复合材料一般具有更优异的热力学性能和稳定性。因此，可生物降解材料在单一体系和混合体系中的生物降解速率有所不同，研究复合材料的热力学性能有利于更全面地对其降解性能进行分析。此外，前沿科学家们正致力于研究材料化学结构对其生物降解性的影响、开发可循环回收材料、通过基因工程手段研制用于降解传统塑料的酶制剂等，旨在更加有效地解决塑料污染问题。