液相色谱-原子荧光联用测定海水及浓盐水中硒形态

李艳苹，王翠翠，赵剑超，马明远，刘小骐，高 艾

(自然资源部天津海水淡化与综合利用研究所，天津 300192)

0 引 言

元素在环境中的效应与它的总量有关，更与它存在的化学形态紧密相关[1-2]。硒元素具有抗氧化、抗癌以及拮抗重金属毒性的作用，是动物和人体需要的有益痕量元素，但是环境中过量的硒又会致人、畜中毒[3]，以及肠胃功能紊乱、神经功能障碍等，或对生态系统构成威胁[4]。总之，硒元素具有“双重性”的特点[5]，其生物有效性、毒性以及代谢规律与硒存在的形态密切相关，因此引起广大学者的研究和关注。目前硒形态分析的研究已有很多报道，包括食品[6-7]、水产品[8]、生物样品[9]、土壤[10]等领域，但在环境水领域，尤其是海水中的硒形态分析研究较少，开展海水及浓盐水中硒元素的形态分析研究，可为水资源综合利用以及海洋环境质量评估提供分析手段[11]。

随着痕量元素形态分析技术的发展，联用技术已成为元素形态分析的主要手段，它是将离子色谱（IC）、毛细管电泳（CE）、高效液相色谱法（HPLC）等分离技术与原子荧光光谱法（AFS）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）等检测技术，通过在线连接整合，形成一种更快速、更有效的分离和测试技术，具有很高的选择性和灵敏性，有很大的应用优势和应用前景。目前使用较多的是高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法 (HPLC-ICP-MS)和高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法(HPLC-HGAFS)。ICP-MS法具有较宽的线性范围、灵敏度高、干扰少，以及可同时测定多元素或多同位素等优点[12]。但由于该仪器价格昂贵、运行费用较高以及需要精心维护等方面，在实际应用中受到了一定的限制[13]。HPLC-HG-AFS不仅仪器操作简单、分析成本低，而且也具有高选择性、高灵敏性、线性范围宽等特点[14-15]，目前已广泛应用于砷、汞、硒等元素的形态分析。如有文献报道HPLC-ICP-MS测定海水中的硒形态[16]，HPLC-HG-AFS测定海水中的砷形态[14]，但是还没有用HPLC-HG-AFS联用技术进行海水及浓盐水复杂基体中有机和无机硒形态测定的研究。

本实验采用HPLC-HG-AFS联用技术对海水及浓盐水中硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸根（SeO42-）4种硒形态进行了测定分析，对有机硒和无机硒有较好的分离效果，方法准确度高、精密度好，简便快速，为海水及浓盐水中硒形态分析的有效手段。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

ST3100型实验室酸度计（奥豪斯仪器公司）；Milli-Q型实验室超纯水系统（美国密理博公司）；KQ3200B型台式超声波仪（昆山超声仪器公司）；6500型液相色谱-原子荧光联用仪（北京海光仪器公司）。

硒代胱氨酸溶液标准物质、甲基硒代半胱氨酸溶液标准物质、硒代蛋氨酸溶液标准物质、硒酸根溶液标准物质（以 Se计分别为：44.2 µg/g、34.8 µg/g、39.4 µg/g、41.5 µg/g，中国计量科学研究院）；柠檬酸（GR，天津市光复科技公司）；CaCl2、KCl、NaCl、MgCl2·6H2O、MgSO4·7H2O、（AR，国药集团化学试剂有限公司）；KOH（GR，天津津科精细化工研究所）；HCl（GR，天津风船化学试剂公司）；KBH4（GR，东方化工厂）。

1.2 仪器参数

原子荧光工作参数：硒元素灯（主电流80 mA/辅电流40 mA）；载气流量300 mL/min；屏蔽气流量 900 mL/min；负高压：300 V；载流 15% HCl；还原剂0.5% KOH+2.5% KBH4。

液相色谱工作参数：流动相30 mmol/L柠檬酸溶液（pH 4，2% 甲醇）；Hamilton PRP-X100离子交换柱（250 mm×4.1 mm，10 µm）；等度洗脱；泵转速60 r/min；流量 1.0 mL/min；进样体积为 100 µL；开启紫外消解模式。

1.3 样品处理

采用聚乙烯塑料瓶存放样品，使用前将聚乙烯塑料瓶浸泡在硝酸溶液（1+3）中24 h，然后用纯水清洗，晾干备用。海水及盐水样品通过0.45 µm水系微孔滤膜过滤，加硝酸至pH小于2，冷藏存放。

2 结果与讨论

2.1 载流酸度的影响

考察了载流5%～25% HCl对4种硒形态SeCys2、MeSeCys、SeMet及SeO42-测定的影响。结果表明，4种硒形态在不同载流条件下的保留时间基本一致，当载流为5% HCl时，SeCys2和 SeMet两种硒形态没有出峰；当载流在10%～25% HCl范围内，SeCys2、MeSeCys、SeMet和SeO42-4种硒形态均出峰，分离效果较好；当载流为15% HCl时，SeMet信号最强；随着载流酸度增大，SeMet信号减弱，MeSeCys和SeO42-信号略有减弱；为了减少试剂消耗，综合考虑选定15% HCl作为载流。

2.2 还原剂的影响

文献[17]表明，KBH4的用量较大地影响分析的准确度和灵敏度，而且KBH4的水溶液不够稳定，需加入适量的KOH来提高还原剂的稳定性。本实验在0.5% KOH的溶液中分别加入1.5%～5.5% KBH4，考察还原剂对4种硒形态测定的影响。结果表明，4种硒形态的保留时间基本不变，随着KBH4浓度从1.5%增大至2.5%，4种硒形态信号增至最大，但随着KBH4浓度从2.5%继续增大至5.5%，4种硒形态信号均有不同程度的减弱，最终选定还原剂浓度为2.5% KBH4+ 0.5% KOH。

2.3 碘化钾的影响

在0.05% KOH的溶液中分别加入0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的KI，考察碘化钾用量对硒形态测定的影响。实验表明，随着KI的增大，除SeCys2信号先增大后减弱外，其他3种硒形态峰信号逐渐增强，其中SeMet增强最为明显，因此选定碘化钾为0.25% 。

2.4 流动相pH的优化

由于流动相的pH对硒形态的出峰顺序、保留时间以及分离效果有着很大的影响[16]。分别配制不同pH的流动相，考察了流动相pH对硒形态测定的影响，结果如图1所示。流动相pH对SeO42-的分离影响较大，pH在3～7范围内，随着pH的增大，SeCys2和MeSeCys的保留时间逐渐增大，SeMet的保留时间逐渐减小，而SeO42-的保留时间先减小后增大；当pH为3，在10 min时SeO42-形态仍未出峰；当pH为4时，SeO42-峰形更尖锐；当pH为5时，SeO42-的保留时间最小，但与SeMet的色谱峰大部分发生重叠；综合分离效果，选择pH为4的柠檬酸溶液作为流动相。

图1 pH对硒形态保留时间的影响

2.5 流动相浓度的优化

对流动相浓度进行了实验优化，结果如图2所示。当流动相浓度为10 mmol/L时，可分离出SeCys2、MeSeCys和 SeMet三种形态，SeO42-未出峰。当流动相浓度从20 mmol/L增至50 mmol/L，SeCys2和MeSeCys的保留时间基本不变，SeMet的保留时间先减小后增大，但变化不大，而SeO42-的保留时间逐渐变小，变化很大；当流动相浓度为50 mmol/L，SeMet与SeO42-色谱峰不能分开，有部分重叠；当流动相浓度为40 mmol/L时，SeMet色谱峰出现较大鼓包；当流动相浓度为35 mmol/L，可在6.75 min 内完成4种形态分离，但是MeSeCys的信号明显减弱。为了较快完成形态分离，并保证信号强度，选择流动相浓度为30 mmol/L。

图2 流动相浓度对硒形态保留时间的影响

2.6 基体的影响

样品基体盐度（S）对硒形态测定的影响见图3。实验表明，当S在8.5～55范围内，SeCys2与MeSeCys的保留时间基本不变，SeMet的保留时间变化不大，SeO42-的保留时间变化较大，其中随着盐度的增大，SeMet的保留时间逐渐减小，SeO42-的保留时间逐渐增大。当S在35～55之间，4种硒形态的保留时间变化较小。当S=55时，SeCys2与MeSeCys的色谱峰不能完全分开。据保留时间和分离度的情况，当海水样品S≤45时，可以按照基体匹配法进行硒形态的测定；当海水及浓盐水样品S≥45时，可以考虑将样品适当稀释进行测定。

图3 盐度对硒形态测定的影响

2.7 4种硒形态的工作曲线

在优化的实验条件下，测试人工海水配制的硒形态混合标准系列溶液，以各浓度点对相应的峰面积绘制工作曲线，获得线性方程。具体结果见表1，在5～200 µg/L范围内4种硒形态的线性相关系数均优于0.998，在进样量为100 µL，等度洗脱的模式下，SeCys2、MeSeCys、SeMet和 SeO42-的检出限分别为 2.40 µg/L、0.50 µg/L、1.97 µg/L 和 0.53 µg/L，检出限比文献 [18]报道的 SeCys2、SeMet、SeO42-（分别为 4 µg/L、18 µg/L 和 3 µg/L）和文献 [7]报道的SeCys2、MeSeCys、SeMet、SeO42-（分别为3.7 µg/L、1.7 µg/L、4.2 µg/L 和7.2 µg/L）低。SeCys2、MeSeCys、SeMet和 SeO42-的保留时间分别为 2.261 min、2.804 min、4.051 min和8.057 min，硒形态标准溶液的色谱图见图4。

表1 4种硒形态的工作曲线

图4 硒形态标准溶液的色谱图

2.8 海水样品的测定、精密度及加标回收率

对海水及人工盐水进行了加标回收及精密度实验，结果分别见表2和表3。

表2 加标回收试验结果

表3 精密度试验结果

对加标前后的海水样品分别进行了测试，从表2可以看出，当加标量为 5～45 µg/L 时，SeCys2、MeSeCys、SeMet和SeO42-的加标回收率在77.5%～119%之间，回收率良好；对海水和人工盐水加标样品进行了3次的测定，4种硒形态的相对标准偏差为3.5%～12.5%。另外对一人工盐水样品进行了7次测定，结果见表3，4种硒形态的相对标准偏差在7.3%～11.3%之间，精密度良好。该测定方法的回收率及精密度满足标准GB/T 27417—2017 《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》的要求，其中GB/T 27417—2017标准规定浓度水平＜0.1 mg/kg，回收率的偏差允许范围为60%～120%；被测组分在1～100 µg/L之间，其实验室内变异系数允许为15%～30%。

3 结束语

本研究建立了高效液相色谱-氢化物-原子荧光光谱测定海水及浓盐水中硒形态的方法。经实验优化了分析条件：氢化发生反应条件为载流15% HCl，还原剂2.5% KBH4+ 0.5% KOH，碘化钾0.25%，色谱分离的流动相为30 mmol/L（pH 4）的柠檬酸缓冲溶液。该方法采用Hamilton PRP-X100交换柱，在优化实验条件下分离和测定，精密度好，回收率高，满足分析检测的要求，不需进行特殊前处理，操作简便、快速，可在8.5 min内完成SeCys2、MeSeCys、SeMet和SeO42-4种硒形态的分离，可用于海水、浓盐水及海水综合利用排放水中硒形态的测定。