皮革中烷基酚聚氧乙烯醚含量的高效液相色谱质谱法测定

2022-11-22陈汝盼曾安然胡苹

通化师范学院学报 2022年10期

陈汝盼，曾安然，胡苹

烷基酚聚氧乙烯醚（Alkylphenol ethoxylates，APEO）是一类非离子型表面活性剂，主要包括辛基酚聚氧乙烯醚（Octylphenol ethoxylate，OPEO）和壬基酚聚氧乙烯醚（Nonylphenol ethoxylate，NPEO）.APEO具有良好的润湿、乳化、渗透、增稠作用，广泛应用于日用化工、纺织、皮革、农药等行业［1］.大量研究发现［2-3］，APEO具有类似雌性激素的性能，可以通过各种途径侵入人体，危害人体正常激素分泌，在环境中还会降解成内分泌干扰物烷基酚［4］（Alkylphenol，AP），而AP的毒性远远大于APEO.为了保护人体健康和环境，一些国家和地区纷纷制定法规和标准［5］，限制皮革、纺织品及其生产过程中APEO的使用，欧盟76/769/EC法规2003/53/EC指令规定：NP、NPEO含量均≤1 000 mg/kg，Oeko-Tex Standard 100（2018）规定：OP（辛基苯酚）、NP（壬基苯酚）、HpP（庚基苯酚）、PeP（戊基苯酚）、OPEO、NPEO总计≤50 mg/kg.因此，为确保我国鞋服产品能够顺利出口，建立一种简捷、准确测定皮革中APEO残留量的检测方法十分必要.

目前，国内APEO的检测方法研究主要集中于环境［6-7］、纺织领域［8-10］，对皮革的研究较少.马贺伟等［11］采用GC-MS测定皮革中APEO的残留量，通过裂解反应使APEO转化为AP，再用GC-MS检测AP的含量，进而推算出APEO的残留量，但存在前处理步骤及计算过程繁琐、检出限较高等问题.刘显奎等［12］采用液相色谱法测定皮革中APEO的含量，光谱波长定性.HPLC-MS技术由于具有质谱定性，对复杂样品有很强的分离能力，可以有效降低假阳性检测结果.因此，本研究选择甲醇为萃取溶剂，用超声提取皮革样品，再采用HPLC-MS技术对萃取液中的APEO进行检测，外标法定量.该检测方法简捷、准确度高、降低了检出限，对皮革制品中APEO残留量测定具有良好的应用前景.

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 主要仪器

高效液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源）：1290-G6460A，美国Agilent公司；电子分析天平：BSA224S，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；超声波清洗机：KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司；超纯水系统：Milli-Q Gradient，美国Millipore公司；滤膜：0.22 μm，天津市津腾实验设备有限公司.

1.1.2 主要试剂

辛基酚聚氧乙烯醚标准品（商品名：Triton X-100，分子结构式：C8H17-C6H4-（OC2H4）nOH，CAS号：9002-93-1，为多种同系物的混合物（nEO=3～16））（比利时Acros公司）；壬基酚聚氧乙烯醚标准品（商品名：Imbentin-N/63，分子结构式：C9H19-C6H4-（OC2H4）nOH，CAS号：9016-45-9，为多种同系物的混合物（nEO=3～16））（美国Fluka公司）；二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、正己烷（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸铵，纯度≥99.0%（美国Sigma-Aldrich公司）；试验用水：超纯水，自制.

1.2 标准溶液的配制

准确称取OPEO和NPEO标准品各0.010 g，转移到100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容配制浓度为100 mg/L的APEO混合标准溶液，保存于阴凉干燥处备用.移取一定量体积的APEO混合标准溶液，并用甲醇逐级稀释，配置一系列的标准工作溶液（浓度分别为0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L）.

1.3 样品前处理

准确称取经切碎混匀的代表性皮革样品1.000 g，放进玻璃反应瓶中，加入10 mL甲醇后适当摇匀使样品充分浸润.将玻璃反应瓶置于超声波清洗机中（超声温度设为30℃，时间设为15 min）进行超声萃取，取出玻璃反应瓶于室温中自然冷却，将玻璃反应瓶中的萃取液倒入0.22 μm滤膜进行过滤，再将进样瓶中的滤液进行HPLC-MS分析.

1.4 HPLC-MS分析条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（RRHD 2.1×50 mm，1.8 μm）；柱温：40℃；进样量：1 μL；流动相A为5 mmol/L的甲酸铵水溶液，流动相B为5 mmol/L的甲酸铵甲醇溶液；流速：0.5 mL/min；流动相洗脱程序：0～1.5 min，80%～95%B；1.5～2.5 min，95%B；2.5～3.0 min，95%～80%B；3.0～4.0 min，80%B.

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子模式，选择离子监测模式（MS2 SIM）；OPEO选择监测离子：m/z224+44nEO，nEO=3～16（356、400、444、488、532、576、620、664、708、752、796、840、884、928）；NPEO选择监测离子：m/z238+44nEO，nEO=3～16（370、414、458、502、546、590、634、678、722、766、810、854、898、942）；毛细管电压：4 000 V；碎裂电压：135 V；雾化气压力：30 psi；干燥气温度：350℃；干燥气流速：8 L/min.

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C18（RRHD 2.1×50 mm，1.8 μm），具有超高压快速高分离度，在1 200 bar压力下仍能保持稳定，对复杂皮革样品进行快速分离时得到出色的重现性.目标物分离效果好，基线平稳，方法运行时间为4.0 min，大大缩短了检测周期.

试验对流动相进行了优化，考察甲醇-水溶液、甲酸铵甲醇-甲酸铵水溶液作为流动相的情况.结果表明：在同等洗脱梯度条件下，上述体系均能使目标物得到很好分离，但随着甲酸铵溶液的加入，待测组分的质谱响应显著上升.因此，试验选择5 mmol/L甲酸铵甲醇-5 mmol/L甲酸铵水溶液体系为流动相，同时对流动相洗脱程序进行了优化，色谱峰的分离效果和响应性均较好.

图1 为优化的色谱条件下浓度为0.1 mg/L的APEO标准溶液的色谱图，从图中可以看出，目标物分离良好，峰型对称，基线平稳.

图1 APEO标准溶液的高效液相色谱图

2.2 质谱条件的优化

将1 mg/L APEO混合标准溶液在ESI源正离子模式下进行全扫描，APEO目标物经ESI电离生成分子离子，选择丰度较高的分子离子作为定量离子.OPEO和NPEO在正离子模式下形成的分子离子主要有［M+NH4］+和［M+H］+，其中［M+NH4］+响应最强.OPEO和NPEO的分子量分别为206+44nEO和220+44nEO，nEO=3～16，因此，定量离子主要为m/z224+44nEO和m/z238+44nEO.同时，为降低基质干扰，提高检测的灵敏度和选择性，本试验采用选择离子监测模式进行分析.进一步优化了碎裂电压等质谱参数，使OPEO和NPEO的响应值最大化，特征峰明显.

图2和图3分别是浓度为0.1 mg/L的OPEO和NPEO标准溶液的选择离子质谱图.从图中可以看出，分子离子均呈正态分布，相邻离子间间隔一个乙氧基，相对分子质量相差44，OPEO和NPEO目标物响应最高的定量离子分别为576和590，乙氧基（nEO）个数均为8.

图2 OPEO标准溶液的质谱图

2.3 萃取溶剂的选择

称取皮革样品1.0 g，选取二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、正己烷4种溶剂作为萃取溶剂，在同等温度和时间下对皮革样品进行超声萃取，平行样测试.不同溶剂对萃取浓度的影响如表1所示.

表1 不同溶剂对萃取浓度的影响

由表1可知，甲醇的萃取浓度为188.2 mg/kg，正己烷的萃取浓度为188.3 mg/kg，这2种溶剂的萃取浓度值相近，萃取效率最高；二氯甲烷的萃取浓度为180.4 mg/kg，萃取效率次之；乙酸乙酯的萃取效率最差，萃取浓度为160.2 mg/kg.但采用正己烷作为萃取溶剂时，还需将正己烷溶剂氮吹转化为甲醇溶剂后才能上机测试，操作步骤相对繁琐.因此，选择甲醇作为本试验的萃取溶剂.

2.4 萃取温度的影响

称取皮革样品1.0 g，以甲醇作为萃取溶剂，萃取时间为30 min，萃取温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃，将皮革样品瓶置于超声波清洗器中超声提取，平行样测试，结果如图4所示.在30℃时，NPEO萃取结果为215 mg/kg，随着温度的增加，萃取浓度值基本上没有明显变化.因此，超声萃取温度选择30℃.

图4 温度对萃取浓度的影响曲线

2.5 萃取时间的影响

称取皮革样品1.0 g，以甲醇为萃取溶剂，萃取温度为30℃，萃取时间分别为15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min，将皮革样品瓶置于超声波清洗器中超声提取，平行样测试，结果如图5所示.萃取时间为15 min时，NPEO萃取浓度值为150 mg/kg，萃取时间大于15 min后，萃取浓度值随着萃取时间的增加而缓慢增加，但变化不太明显.因此，超声萃取时间选择15 min.

图5 时间对萃取浓度的影响曲线

2.6 线性关系与检出限

分别配制浓度为0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L的OPEO和NPEO标准工作溶液，按照上述HPLC-MS分析条件进行测试（外标法定量），以横坐标（x）表示目标物质量浓度，纵坐标（y）表示特征离子峰面积，作线性回归方程，结果如表2所示.

表2 OPEO和NPEO的线性方程与检出限

由表2可知，在0.05～2 mg/L浓度范围内，目标物OPEO和NPEO质量浓度与特征离子峰面积具有良好的线性关系，r2均在0.999以上.

通过加入一低浓度标准溶液到不含目标物的空白样品瓶中，使空白样品瓶中溶液的浓度为0.4 mg/L，换算成样品的含量为4 mg/kg，按照上述HPLC-MS分析条件并同时做11份样品的测试，用11次测定结果的3倍和10倍标准偏差分别代表本方法的方法检出限（LOD=3SD）和定量限（LOQ=10SD），方法检出限分别为0.42 mg/kg和0.54 mg/kg，定量限分别为1.4 mg/kg和1.8 mg/kg.

2.7 回收率和精密度

在不含目标物的空白样品瓶中分别添加3种不同浓度（4 mg/kg、20 mg/kg、200 mg/kg）的APEO混合标准溶液，每个浓度取6个平行样，按照上述HPLC-MS分析条件进行测试，结果如表3所示.回收率结果越接近100%，表明分析方法准确度越高.OPEO和NEPO在3个加标水平下的平均回收率分别为79.5%～90.7%和83.0%～119.5%，回收率良好，表明该测试方法准确性较高.同时，相对标准偏差（RSD，n=6）分别为2.4%～3.2%和0.3%～4.3%，说明实验测试精密度高，本方法可用于皮革制品中OPEO和NPEO目标物的测定.

表3 平均回收率和相对标准偏差（n=6）

2.8 实际样品的检测

用上述方法对5份皮革样品进行测试.由表4可知，阳性皮革样品检出个数为2个，检出率为40%，检出的目标物只有NPEO，检测结果范围为27～1 001 mg/kg，而目标物OPEO均未检出.虽然有的皮革样品中目标物NPEO含量远低于欧盟REACH法规的限量要求（1 000 mg/kg），但是也有的皮革样品含量略大于1 000 mg/kg，说明壬基酚聚氧乙烯醚在皮革制品中的应用较为普遍，对人类健康和环境存在潜在风险，应引起人们的关注.