应激致功能性下丘脑性闭经动物模型研究进展

万坤铭，孙 帅，俞超芹

(上海长海医院中医妇科，上海 200433)

功能性下丘脑性闭经(functional hypothalamic amenorrhea,FHA)是除外下丘脑、垂体等器质性病变，由于循环中促性腺激素和雌激素水平均低而导致的一种好发于年轻女性的中枢性闭经。FHA是现代女性常见的闭经原因之一，据估计，在所有继发性闭经中FHA占15%～48%[1]。FHA对女性健康包括生殖系统、心血管系统、骨骼和心理状态等造成威胁。FHA的基本特点是下丘脑-垂体-卵巢(hypothalamic-pituitary-ovarian,HPO)轴的抑制。正常的生理情况下，下丘脑通过脉冲式分泌促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)促进垂体前叶分泌卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)和黄体生成素(luteinzing hormone，LH)，FSH的主要功能是刺激卵巢生长及卵泡发育；LH的功能是促进卵泡最后成熟，触发排卵，促进黄体形成维持其功能；两者相互配合促进卵巢合成分泌3种性激素，即雌激素、孕激素、雄激素，而雌激素、孕激素对下丘脑和垂体又有反馈调节作用[2]。FHA由于GnRH脉冲式分泌不足，导致FSH、LH水平降低致使雌激素水平低下，正常的生殖内分泌稳态被打破[3]。越来越多研究[4-6]表明，FHA的发生发展与能量代谢和精神压力密切相关，其具体诱因一般包括体重减少或营养不足、高强度运动训练、各种因素导致的心理压力过大等[7-9]。为更好地建立稳定有效的FHA动物模型，笔者从FHA病理生理及临床特点出发，结合相关文献，探讨可能有效的FHA的动物造模方式，为今后的相关实验提供助益。

1 心理应激

1.1 造模方式及应用

1.1.1 束缚应激

束缚应激是目前常用的一种模拟心理应激的模型之一，它能较好地模拟人类社会生活中拥挤、压力大、挫折等生活状态。束缚应激通过固定实验对象的四肢或将实验对象放置于特制的容器内剥夺其一定程度的活动自由。YANG等[10]研究了急性束缚应激对雌性小鼠的LH脉冲、RFamide-related peptide 3(Rfrp3)、Kisspeptin的表达和相应神经元激活的影响。该实验首先将小鼠双侧卵巢切除，之后进行180 min的连续LH监测(每5 min取3 μL尾尖血进行检测)，前90 min所有小鼠处于自由活动状态，后90 min对照组小鼠仍然自由活动，但应激组小鼠均被置于特制狭小容器内。结果显示束缚应激能明显地抑制LH的脉冲式分泌。式样进一步研究发现束缚180 min后，相对于对照组，应激组Rfrp细胞数量显著增加20%，Kiss1和cfos的共表达显著减少(P<0.05)。KINSEY JONES等[11]发现相似的结果，他们的实验中大鼠在束缚60 min后即出现LH的分泌抑制，以及下丘脑Kiss-1的表达量下降(P<0.05)。

除了急性束缚，在慢性束缚应激方面也有学者做了研究。韩洁等[12]建立重复制动大鼠模型，研究慢性束缚对雌性大鼠HPO轴的影响。他们将40只SD大鼠随机分为对照组和束缚组各20只，对照组正常饲养，束缚组采取递增负荷束缚应激，每天置于束缚器内束缚应激1次，第1日束缚2 h，以后采用递增负荷，每日增加0.5 h，持续2周。结果发现束缚组大鼠动情周期明显延长，LH、雌二醇(E2)含量显著低于对照组(P<0.05)，下丘脑GnRH，垂体促性腺激素释放激素受体(gonadotropin releasing hormone receptor,GnRHR)、FSH、LH的mRNA表达量显著下降(P<0.05)。FOTSING等[13]同样也发现，慢性束缚应激(每天束缚3 h，共造模28 d)造模下的雌性大鼠动情期时间减少，血清FSH、LH、E2水平都显著低于对照组(P<0.05)。这些实验都提示慢性束缚应激能干扰HPOA的内分泌调节功能。

1.1.2 慢性不可预测应激

慢性不可预测应激(chronic unpredictable stress，CUS)是一种多因素复合型应激方式，主要包括束缚、游泳、悬尾、昼夜颠倒、噪音、拥挤饲养、冷水刺激等，是目前最为常见的抑郁症造模方式之一。一般来说，实验动物每天会被随机赋予一到两种应激源的刺激，相邻2 d的应激方式避免重复，或者同种应激方式强度逐渐增强，以避免动物出现适应现象，造模持续时长一般在2周以上。有研究[14]表明，慢性不可预测应激4周可导致雌性大鼠下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)轴兴奋与HPO轴的抑制，导致血清皮质酮(corticosterone,CORT)、促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)水平显著提高，FSH、LH、E2显著降低(P<0.05)。

1.1.3 其他造模方式

王建红等[15]采用声-光-电复合刺激雌性大鼠，先是噪音加强光刺激大鼠10 s，之后立即加上点击足底60 s，如此造模20 d，发现大鼠动情周期紊乱，血清E2、P水平显著低于对照组，垂体、卵巢重量偏低(P<0.05)。而WAGENMAKER等[16]以母羊为研究对象，依照隔离饲养80 min、蒙住双眼80 min、犬吠刺激80 min顺序接受刺激，发现母羊的下丘脑GnRH、垂体LH的脉冲式分泌幅度被大幅抑制。

1.2 模型评价

依据文献来看，各种心理应激造模方式相比，束缚造模方式更为稳定。FHA是长期因素导致的疾病，故而各种急性应激的造模方式，虽能导致LH或GnRH的脉冲式分泌被抑制，但终究不合适作为FHA的造模方式。长期束缚应激造模的缺陷在于，造模方式的单一容易引起动物适应，虽然可以通过增加束缚时长解决这一问题，但过长的造模时长也有问题，韩洁[17]的另一项研究发现每天束缚6 h，3个月后会出现卵巢损伤，导致FSH水平上升。

CUS造模方式差异性大，从KATZ等[18]于1981年创立至今，具体采用哪些应激源，采用怎样的应激强度，仍然千差万别，不同的应激源和应激强度会导致不同的造模效果。比如，同样是CUS法造模，FU等[19]显示大鼠卵巢早衰发生，FSH水平显著提高；GAO等[20]的结果之一也是FSH水平的显著上升。这与FHA的激素变化特征不一致。

总之，对于FHA的造模，在心理应激方面，慢性束缚应激可能是较为稳定的一种造模方法。

2 能量限制

2.1 造模方式及应用

控制能量维持在低水平，其最直观最常用的方法就是控制食物摄入量，只为实验动物提供少于其正常需求量的食物。以老鼠为例，通常将其单笼饲养，通过前期测定或根据对照组的进食量预估其每日食物正常需求量，之后每日提供其少于此量的食物，以达到食物限制的目的。栗丽[21]依据此法研究能量限制对成年雌性大鼠生殖潜能的影响，他们将成年雌性SD大鼠随机分成对照组、25%能量限制组(每只大鼠每日摄食量为对照组的75%)、45%能量限制组(每只大鼠每日摄食量为对照组的55%)，结果发现实验结束后，25%能量限制组大鼠有25%动情周期不规则，45%能量限制组有60%动情周期不规则；通过对血清激素的检测，发现实验第4周时，两能量限制组大鼠血清LH、FSH与对照组相比均有明显下降(P<0.05)。陈晓纯等[22]同样发现25%能量限制8周时有近55%(6/11)SD雌性大鼠出现动情周期紊乱。AHMED等[23]发现50%食物限制的SD大鼠，1个月后LH、FSH、E2水平均显著降低(P<0.05)，并且发现这可能与其下丘脑kisspeptin、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,cdc2)、细胞周期蛋白B的表达量下降有关。

也有研究者选取其他哺乳动物进行实验。LI等[24]将青春期前母羊分为对照组、低限食组(每天每只羊食物摄入量为对照组70%)、高限食组(每天每只羊食物摄入量为对照组50%)，限食53 d后，发现与对照组相比，两限食组的下丘脑RFRP-3表达量显著增加，下丘脑和垂体的GnRHR表达量显著下降，垂体中的FSHR以及下丘脑中的LHR表达量也显著低于对照组(P<0.05)。ZHOU等[25]观察了营养限制对母猪生殖内分泌相关激素水平的影响，发现与正常饲养母猪(每只每天进食量为2.86 kg)相比，营养限制的母猪(每只每天进食量为1 kg)循环血中IGF-1、E2、FSH、LH、孕酮、瘦素水平显著下降(P<0.05)；同时明显下调了下丘脑kisspeptin、GnRH、ERα的基因表达(P<0.05)。

这些研究都提示，食物限制对于雌性哺乳动物HPOA有着明确的抑制作用，并且与下丘脑的变化紧密相连。

2.2 模型评价

一定程度的食物限制能明确地下调血清LH、FSH、E2水平，但如果这一过程过长，则造模效果可能会下降。上述栗丽[21]的研究进行到第10周时，与对照组相比，FSH水平已无明显差异(P>0.05)，LH水平反而较第4周时有所回升。林旋豪[26]开展了类似研究，却发现40%能量限制1个月后LH水平与对照组无明显差异(P>0.05)。这提示，若要尝试用食物限制的方法造模FHA，其造模强度和时长需要进一步探索。

3 运动疲劳

3.1 造模方式及应用

3.1.1 跑台运动

跑台运动是常见的强迫实验动物运动的方法之一，通过长期递增负荷的跑台运动可以使动物进入并长期处于运动疲劳状态。一般而言，研究者会通过定时增加跑步时间、跑台速度、跑台坡度来增加实验动物的运动负荷量，从而达到造模效果。

郑陆等[27]依据此法造模发现，长期递增负荷跑台运动的大鼠其动情周期逐渐紊乱，其下丘脑GnRH、血清LH、E2、孕酮(P)、睾酮(T)水平均随着运动周数的增长逐渐下降，自第7周开始均有显著差距，至第9周达到最低值(P<0.05)；而血清FSH水平虽有下降的趋势，但始终与对照组相比无明显差距(P>0.05)。王人卫等[28]进行了相似研究，通过血清学检测获得类似结果，但他们同时发现长期递增负荷跑台运动，大鼠下丘脑及血浆中的β-内啡肽(β-EP)显著增高(P<0.05)，下丘脑弓状核神经元轴突髓鞘分离、树突肿胀、核周质线粒体空泡变，这说明这一造模方式确实能在下丘脑层面引起病理变化。

3.1.2 强迫游泳

强迫游泳也能造成实验对象运动疲劳状态。其基本原理是利用实验对象的恐水特性，强迫其进行游泳活动，使其力量便逐渐衰竭，重复这一过程就能达到运动疲劳状态。以大鼠强迫游泳为例[29-31]，通常其水深必须在大鼠全长的1.5倍以上；水温需要控制在一定范围内；为加快其力量耗竭，可在大鼠尾部悬挂重物，质量为3%～5%大鼠体重；当大鼠游泳动作明显失调，沉入水面以下10 s未能浮出水面，则判定为力竭，立即捞出，捞出后必须擦干身体，然后放回原鼠笼。多项研究表明[31-32]，应用此法造模3周，能使得雌性大鼠FSH、LH、E2、P、T水平均显著下降；周圆[29]使用类似方法，造模6周后所有大鼠动情周期消失。而另有研究[33]表明，强迫游泳致动情周期紊乱的大鼠，其下丘脑多种单胺类递质水平显著下调，如多巴胺、5-羟色胺等，而这些递质与下丘脑GnRH的脉冲分泌密切相关。

3.2 模型评价

两种运动造模方法相较而言，跑台运动造模总时长似乎比强迫游泳更长，但跑台运动造模的优势在于实验条件更易于控制，包括跑台的坡度、跑台的速度等可以精准地调节。相比之下，强迫游泳的水温、悬挂重物都难以精准控制。并且实验条件的控制各研究均不完全统一，比如水温的控制，在20～34 ℃区间内，浮动较大；是否悬挂重物，悬挂重物质量的大小也没有统一。这些因素对于游泳达到力竭状态的时长均有很大影响。同时，有很多研究[29-31]报道，强迫游泳至力竭对卵巢有直接损伤，包括卵巢形态学的改变和对卵泡细胞的影响。

4 多因素复合

4.1 造模方式及应用

利用心理应激加上能量限制复合因素，或许能更好地达到造模目的。胡文晓等[34]利用束缚加食物限制的方法制造神经性厌食症模型，他们将大鼠每日束缚2 h，定时移除饲料和水2.5 h。造模35 d后，其动情周期紊乱率达100%，血清E2、FSH、LH水平显著低于对照组，其下丘脑β-EP水平显著高于对照组(P<0.05)。

还有研究者[35]将心理应激与运动疲劳相结合进行造模，利用束缚+游泳+昼夜颠倒+空瓶刺激雌性大鼠，每日游泳30 min，束缚60 min，隔日进行1次昼夜颠倒(白天置于黑暗环境。夜晚给予模拟的日光照明)，随机给与空瓶刺激(每笼2个水瓶，随机撤去其中0～2个水瓶中的水)。造模46 d后，动情间期明显延长，血清LH、FSH，以及下丘脑GnRH显著低于对照组(P<0.05)。

此外，BETHEA等[36]将心理应激、能量限制、运动疲劳三者结合，以食蟹猕猴为研究对象进行FHA造模。通过将猕猴单独移动至陌生环境，使其被陌生动物包围模拟心理应激；减少其每日进食量的20%达到能量限制；将猕猴置于封闭跑步机内强迫其以80%最大速度奔跑1 h，每周跑步运动5 d，从而造成运动疲劳。实验分5个周期进行，每个实验周期持续一个完整的月经周期。第1个周期是完全空白对照，不做任何处理；第2个周期是对跑步机的学习训练；第3个周期开始造模；第4个周期仍然是造模，不过模拟心理应激的陌生环境被更换；第5个周期是无应激的恢复期。结果有1/3猕猴于第3个周期结束时没有月经，1/3猕猴于第4个周期结束时没有月经。并且通过对整个月经周期血清学的监测，发现猕猴的雌、孕激素周期性的升高消失。进一步对猕猴下丘脑进行神经生物学研究，发现月经消失的猕猴其下丘脑弓状核与正中隆起处的表达GnRH的神经元数量显著低于对照组(P<0.05)。

4.2 模型评价

从FHA的病因上看，复合因素造模更为贴合临床FHA患者的病史特征，多重因素的复合应激造模应该更容易成功造模，但这些复合造模法并没有表现出比单一因素造模更好的造模效果或更优的造模流程。同时，多种因素的复合意味着更多无关变量的增加，实验条件的控制更难。

5 结语

成功制造FHA动物模型须紧紧围绕FHA的三大诱因：即心理压力、过度疲劳运动，能量摄入不足。心理应激主要是激活机体的HPA轴，而HPA轴的过度激活与HPO轴的抑制密切相关[37]，并且这一特征与FHA患者的临床观察指标相一致[38-39]，而在能量限制的造模中，通常血清CORT也会显著升高[40-41]。相比之下，运动疲劳造模法则不完全一样，运动和限食对于HPA的影响更为复杂。比如，有研究[42]发现负重游泳的大鼠，2周后，其下丘脑CRH，垂体ACTH，血清CORT均显著降低，HPA轴被抑制,在使用过度运动法造模时需要注意这一问题。

此外，使用心理应激与过度运动应激应该注意应激强度和造模时长的控制，过长的造模时长与过强的应激强度都会导致实验动物的卵巢严重损伤，导致FSH不降反升，目前尚未在能量限制造模中发现这一问题；并且诸多研究[40,43]发现,长时间限食对大鼠卵巢生殖寿命还有一定的延长作用，较低程度的限食能使30%的大鼠限食93 d后，较对照组的卵巢原始卵泡明显更多，卵巢储备增加；而20%限食的大鼠不仅能增加卵巢储备，还能维持正常生殖功能。