VEGF-A在肾脏疾病中的研究进展

吴 瑶，柯 本，房向东，涂卫平

(南昌大学第二附属医院肾脏内科，南昌 330006)

血管内皮生长因子(VEGF)也被称作血管通透性因子(VPF),是新生血管形成的重要介质。20世纪末，SENGER等[1]首先从肿瘤细胞的培养液中纯化得到VEGF分子，并证明其可以诱导血管渗漏；而后，LEUNG等[2]发现该分子也是血管内皮细胞特异的有丝分裂原,能够引起强烈的血管生成反应。VEGF-A作为VEGF家族的重要一员，已经被发现在肾脏血管网系统的形成和发育阶段发挥关键性作用[3]。VEGF-A的异常表达与肾脏疾病有着密切联系，并且VEGF-A抑制剂和VEGF-A补充治疗都在肾脏疾病实验模型中显示了一定的肾脏保护作用。本文主要总结和讨论了血管内皮生长因子VEGF-A对正常肾脏生理的维持以及它在肾脏疾病中的作用。

1 VEGF-A的概述

VEGF基因家族中含有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及PIGF(胎盘生长因子)，它们的基因产物以同二聚体的形式发挥作用并且由于其分子大小以及结合肝素、硫酸乙酰肝素或神经纤毛蛋白的能力不同而具有不同的扩散性和局部活性[4]。其中VEGF-A是人类VEGF的主要亚型,也是最有效的血管生成诱导剂之一。

VEGF-A基因含有8个外显子和7个内含子，对外显子进行选择剪接后产生一系列促血管生成的亚型，一般称为VEGF-Axxx(VEGF-A121,VEGF-A145,VEGF-A165,VEGF-A189和VEGF-A206,其数字表示氨基酸的数量)。对第8外显子上的特异性剪切位点作用可以形成功能不同的亚型，称为VEGF-Axxxb，肾脏中最常见的亚型为VEGF-A165b[5]。

VEGF-A的生理效应由2个同源VEGF-A受体结合所驱动:VEGFR-1(小鼠中为Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1;KDR)[6]。在成人中,VEGFR-1和VEGFR-2主要分布在血管内皮细胞中,而VEGFR3主要在淋巴管内皮细胞[7]。此外,VEGF-A与不同VEGFR亚型的作用效应和亲和力也不同。VEGFR-1对VEGF-A反应轻微激活;然而,VEGFR-1结合VEGF-A的亲和力却比VEGFR-2提高了10倍。最新的研究[8]也表明,VEGF-A的各种剪接变异体亚型在与VEGFR结合的亲和力中表现出不同,其中VEGF-A165b抗血管生成亚型优先结合VEGFR2，与促血管生成亚型VEGFA-121及VEGFA165a相反。

2 VEGF-A对正常肾功能的维持

肾小球滤过屏障(GFB)由脏层上皮细胞(足细胞)、有窗孔的毛细血管内皮细胞和中间的基底膜组成。足细胞VEGF-A的旁分泌以及自分泌作用对GFB的发育和完整性必不可少。在肾皮质中,足细胞表达和分泌VEGF-A占大部分,而小管上皮细胞分泌较少。ROBERT等[9]在发育中的肾小球检测到,VEGF-A的几种主要亚型在足细胞内大量表达,其中VEGF-A164亚型表达最丰富。免疫电子显微镜研究[10]显示,VEGF定位于足细胞足突、肾小球基底膜(GBM)以及内皮的管腔和非管腔表面,并证明足细胞分泌的VEGF可以通过肾小球滤液逆流向内皮细胞。VEGF-A表达在肾小球发育的S形阶段首先被检测到,此时足细胞前体与发育中的毛细血管裂隙直接相邻。随后,肾间质中存在的Flk-1阳性内皮细胞前体在VEGF阳性的足细胞作用下迁移到血管裂隙中进行增殖和分化[7]。这2种细胞的相互作用表明足细胞分泌的VEGF能够促进内皮细胞迁移、生长和存活，即足细胞旁分泌发挥作用。有趣的是,足细胞自身也能表达功能性VEGFR2,尤其是在足突上。Nephrin蛋白是狭缝隔膜的基本跨膜蛋白,足细胞释放的VEGF-A与足突上的Nephrin-VEGFR2复合物结合后将信息传导到足细胞肌动蛋白细胞骨架,从而影响狭缝横膈膜的功能和维持GFB的完整[11]。此外,FOSTER等[10]报道VEGF-A可以调节足细胞的Ca2+稳态和保护足细胞存活。CD2相关蛋白(CD2AP)是一种狭缝隔膜的相关支架蛋白,最近的研究[12]表明VEGF-A刺激可诱导足细胞CD2AP分子中的SH3-1结构域Y10位置的酪氨酸磷酸化反应,并且该磷酸化反应对Nephrin蛋白的稳定性必不可少,可能是足细胞内源性维持机制的一部分。除此之外，DIMKE等[13]发现VEGF-A可由肾小管上皮细胞表达，而其受体(KDR/VEGFR2)的表达主要在相邻的管周毛细血管中。特异性敲除肾小管VEGF-A后，小鼠肾脏变小，管周毛细血管密度显著降低。

3 VEGF-A与急性肾损伤

急性肾损伤(AKI)是一种严重的临床疾病,其特点是血肌酐迅速增高、肾小球滤过率(GFR)迅速减少。AKI患病率在过去几十年呈逐渐增加趋势，它也是慢性肾脏病(CKD)迅速发展并进展成终末期肾病(ESRD)的重要危险因素[14]。由于尿量和血清肌酐在检测肾损伤的早期阶段方面并不理想，往往不能及时诊断AKI。有研究[15]表明，高水平的VEGF促血管生成因子与较低的AKI患病率(31%)和死亡率(54%)风险相关。因此，对血管生成等过程进行深入研究将有助于诊断和设计治疗AKI的策略。

早期VEGF-121治疗可以保护缺血-再灌注(I/R)小鼠模型的肾脏微血管结构,并改善慢性肾功能[16]。缺血再灌注损伤(IRI)为AKI的主要病因，I/R小鼠实验模型也被广泛运用于AKI的机制研究。肾缺氧可以发生在不同病因的AKI中,而缺氧诱导转录因子(HIF)的激活已被确认为是细胞适应低氧环境的重要机理[17]。HIF在氧充足条件下表达，可以被羟化酶抑制剂(PHD)降解；低氧条件下PHD活性较弱，稳定的HIF可以激活多个促血管生成基因，VEGF-A也是HIF的一个靶基因。最近研究[18]表明，HIF脯氨酸羟化酶抑制剂在急性缺血和CKD中可通过稳定HIF来改善VEGF-A反应从而增强肌肉血管生成。SNCHEZ NAVARRO等[19]利用肾切除术加I/R模型探讨AKI向CKD发展的机制,发现HIF1α结合位点VEGF-A启动子基因高度甲基化,导致再灌注后VEGF-A一直处于降低水平。VEGF-A水平下降导致血管稀疏,进而使慢性缺氧永久化,促进肾缺血损伤后CKD的发展。间充质干细胞(MSC)移植是一种在AKI中恢复肾小管结构和改善肾功能的新技术。VEGF修饰的hMSC植入顺铂诱导的肾损伤裸鼠模型，与单独MSC植入相比，可增强MSC抗凋亡作用、改善微循环和细胞增殖,在预防AKI方面提供更大的益处[20]。这些研究均表明上调VEGF-A和HIF的水平对AKI起到保护性作用。然而,XU等[21]发现miR-195-5P负性调控靶基因VEGF-A,抑制炎症和氧化应激从而减轻AKI。这表明VEGF-A在AKI的发展中也可起促进作用。VEGF-A在AKI中的具体机制还有待进一步研究。

4 VEGF-A与糖尿病肾病

糖尿病肾病(DKD/DN)是糖尿病的一种高流行的并发症,大约30%～40%的糖尿病患者进展为DKD[22]。它不仅是导致终末期肾病的主要原因,而且还是糖尿病患者全因死亡率和心血管疾病(CVD)死亡率过高的主要因素[23]。DKD的主要临床特点是蛋白尿和进行性肾功能衰竭,组织学特征为肾小球基底膜进行性加厚、肾小球系膜基质的积聚及晚期伴或不伴有微动脉瘤和系膜溶解的Kimmelstiel-Wilson结节性疾病,最后出现肾小球硬化[24]。异常血管生成已被发现与DKD的病理生理学重要相关[25]。然而,目前抗血管生成治疗局限于糖尿病患者视网膜病变的治疗,DKD的血管生成机制仍然有待进一步研究。

在实验性DKD早期,VEGF-A水平已被证明显著升高。影响糖尿病发展的各种病理因素与肾脏VEGF-A水平变化相关。高糖水平(HG)可通过血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)和胞外信号调节激酶(ERK)刺激肾近端小管上皮细胞VEGF的合成[26]。HG也可以通过激活蛋白激酶C(PKC)和ERK刺激足细胞中VEGF164的生成[27]。晚期糖基化终产物(AGEs)通过增加核因子-κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)上调VEGF mRNA水平[28]。此外,足细胞表达胰岛素受体,胰岛素以neprhin依赖的方式增加足细胞中VEGF-A mRNA和蛋白质水平。体外或体内下诱导足细胞胰岛素抵抗时,VEGF-A的生成受损且发生在胰岛素抵抗导致足细胞损伤之前[29]。同样,异常VEGF-A通过不同机制促进DKD的发展。“VEGF-A与NO解偶联”可能是DKD患者体内血管异常的主要机制之一。DKD患者肾脏NO生物利用度率低,VEGF-A水平升高。内皮细胞分泌的NO是一种抑制因子，可以防止过多的内皮细胞增殖，血管平滑肌细胞增生和巨噬细胞浸润。VEGF与NO解偶联可通过KDR(VEGFR2)和ERK途径促使内皮细胞增殖和巨噬细胞趋化，形成病理性血管[30]。最近研究[31]表明,低水平的β2糖蛋白I(β2GPI)可以部分逆转高血糖引起的VEGF-NO轴解偶联；β2GPI是一种主要由肝细胞合成的血浆磷脂结合蛋白。

在DKD早期使用VEGF-A抑制剂可以上调磷酸化AKT水平而减少足细胞损伤和改善肾功能[32]。BUS等[33]在链脲佐菌素(STZ)诱导1型糖尿病小鼠模型之后进行sFLT-1(VEGF-A抑制剂)转染,结果发现转染FLT-1可使蛋白尿、肾小球肥大情况和系膜基质含量(即肾小球IV型胶原蛋白水平)正常化,从而显著降低肾脏损伤。进一步发现sFLT-1转染可减少内皮细胞活化、肾小球巨噬细胞浸润和肾小球TNF-α蛋白水平。sFLT-1转染是在小鼠造模5周后进行,已经证明发生了肾损害。这表明VEGF-A抑制剂在DKD小鼠模型中起到逆转肾损伤的作用。此外,大量证据表明VEGF-A抗血管生成亚型VEGF-A165b可能发挥重要的肾脏保护作用。OLTEAN等[34]发现早期糖尿病肾病患者的肾脏中VEGF-A165亚型水平升高,而晚期肾病患者的肾脏中VEGF-A165b亚型水平升高；在糖尿病小鼠中通过足细胞特异性VEGF-A165b表达或重组人VEGF-A165b给药可减少蛋白尿,而在培养的足细胞或内皮细胞中VEGF-A165b以VEGFR-2依赖性方式减少高糖诱导的细胞凋亡；同时还发现VEGF-A165b可以恢复肾小球内皮糖萼进而保护肾功能。VEGFR2激酶抑制剂SU5416可减轻系膜基质扩张和基底膜增厚、肾小管间质炎症和肾小管萎缩和改善2型糖尿病小鼠的蛋白尿[35]。上述发现表明,通过抑制VEGF-A可能是DN患者的一种潜在治疗方法。然而,SIVASKANDARAJAH等[36]发现肾小球VEGF-A特异性敲除的小鼠诱导1型糖尿病产生更严重的肾脏损伤。此外VEGF-A抑制剂在糖尿病视网膜病变患者中的临床应用也显示出有争议的结果[37]。这说明VEGF过低或过高都可能是有害的。因此,DN患者的抗VEGF-A治疗必须保持VEGF-A表达在正常水平范围。

5 VEGF-A与多囊性肾病

多囊性肾病(PKD)患者的肾脏中含有多个充满液体的囊肿，破坏正常肾脏结构和功能，常导致ESKD。常染色体显性遗传性PKD(ADPKD)是最常见的PKD形式，通常是一种发生于成人的多系统疾病，其主要原因为分别编码多囊素1和2的PKD1和PKD2基因发生突变[38]。PKD1和PKD2基因定位于肾小管上皮细胞，其编码的多囊素1和2蛋白功能障碍使细胞内钙信号减少，细胞内环磷酸腺苷(cAMP)升高，蛋白激酶A依赖性基因的转录增加，引起肾小管上皮过度增生并最终导致囊肿形成和扩张[39]。大量研究[40-41]表明，囊肿的生长除了与肾小管上皮机制有关外，也与血管生成有关。SONG等[42]对ADPKD患者不同大小的囊肿的转录组分析显示，与最小囊肿组织相比，体积更大的囊肿中VEGF-A上调。此外，VEGF-A在健康小鼠肾小管中的靶向过表达导致了囊肿形成亦支持VEGF-A的致病作用[43]。在另一项对肾功能正常的年轻ADPKD患者的研究[41]中，患者循环VEGF-A增加，血清VEGF-A水平与肾脏总容积和囊肿容积相关。需要更多PKD与血管生成的动物和细胞研究来揭示所涉及的分子机制，可能为ADPKD提供潜在的新治疗靶点。

6 VEGF-A与其他肾小球疾病

基于VEGF-A在GFB发育和维持中的重要作用,VEGF-A在各种肾小球疾病包括IgA肾病(IgAN)、膜性肾病、微小病变型肾病中也表现出异常,具有潜在的治疗价值。

IgAN是最典型的原发性肾小球肾炎,也是我国终末期肾病(ESRD)的主要病因。IgA肾病主要机制是存在循环和球状免疫复合物,包括缺糖IgA1、针对铰链区域O-glycans的IgG自身抗体和C3[44]。最新的一项研究[45]中,IgAN患者肾活检显示VEGF-A在肾小球各类细胞和肾小管上皮细胞中的表达增加,尿VEGF-A水平也显著增加,该研究小组进一步研究IgAN患者尿VEGF-A水平与肾脏预后的关系,随访了63例IgAN患者,平均随访38个月,发现尿VEGF-A基线水平较高的IgAN患者肾脏预后较差。

局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)是一组肾小球组织学疾病,被认为是导致ESKD的最常见球状病因。不同病因引起的FSGS有共同临床特征：足细胞的损伤和病变[46]。HIV病毒相关的肾脏并发症表现为FSGS塌陷。在表达HIV-1的小鼠足细胞中可观察到VEGF-A水平升高[47]。在VEGF-A以足细胞特异性方式过度表达的动物模型中也观察到这种FSGS表型[48],表明VEGF-A表达可能与HIVAN的发病机制有关。然而,在一项对抗VEGF-A治疗的癌症患者出现肾脏不良反应的回顾性研究[49]中,出现FSGS样病变占27%,主要由酪氨酸激酶抑制剂引起。说明过表达和抑制VEGF-A水平均可引起FSGS样病变。有趣的是,膜性肾病伴局灶性节段性肾小球硬化病变(MN-FSGS)组比MN不伴FSGS组显示出明显的GBM厚度增加、ECM积聚以及足细胞损伤伴有足突消失,但两组足细胞上VEGF的表达没有差异[50]。VEGF-A在FSGS中的作用有待进一步证实。

膜性肾病(MN)一种肾脏局限性自身免疫性疾病，多发生于成人。目前临床上使用传统疗法免疫抑制剂联合糖皮质激素以及利妥昔单抗疗法仍存在争议和挑战，部分原因则是对该病发病机制的了解不足，以及缺乏敏感的疾病活动生物标记物[51]。抗磷脂酶A2受体(PLA2R),1型血小板反应蛋白7A域(TSHD7A)是特发性MN患者足细胞最主要的两种自身抗原。MATSUMOTO等[52]报告的2例THSD7A相关的MN合并血管淋巴样增生伴嗜酸性粒细胞增多症(ALHE)中，发现VEGF-A可以上调THSD7A的表达。这为MN的发病机制研究提供了新的方向。

7 小结

VEGF-A以及其他血管内皮因子在肾脏发育和肾脏疾病中起着重要作用。VEGF-A抑制剂在各种癌症中的运用中得到了发展,但也导致肾脏各种病理损伤。在DN中,尽管VEGF-A抑制治疗还未从实验转向临床,但在阐述血管生成机制的复杂性方面取得了重要进展。VEGF-A的水平在监测各种肾小球疾病的预后方面也有重要作用。此外,VEGF-A剪接亚型VEGF-Axxb的肾脏保护作用研究也为肾脏疾病提供了新的治疗靶点。