数字聚合酶链式反应在检验诊断中的应用进展

刘雅楠 张彤 赵国强 魏凤香，3★

自1983年PCR 这一革命性技术诞生以来，这种核酸分析方法一直处于检测领域的领先地位。随着分子生物技术的不断发展，PCR 技术不仅局限于体外无限扩增目的基因，而是从定性向更精确的定量转变。数字聚合酶链式反应（digital poly⁃merase chain reaction，dPCR）作为一种新的DNA定量技术，具有比传统PCR 更快、更精准、重复性更好的特性，已逐渐成为生命科学领域最引人瞩目的创新之一，并在检验诊断中快速推广。该技术不仅可用于临床诊断和结果验证，还可用于疾病随访和疗效观察，在疾病发现和治疗方面具有很大优势，对提高国民健康水平具有很高的发展前景和研究价值。本文总结了最近几年dPCR 技术在检验中的应用进展和优势。

1 技术原理和优势

dPCR 是结合了传统PCR 简单操作的特征和实时荧光定量PCR 准确定量的特征发展而来的第三代PCR 技术［1］。同传统PCR 相比，dPCR 增加了对反应体系进行分隔的操作，将几十微升的反应体系分隔成了数万微小独立反应体系，核酸模板在这种分隔过程中被充分稀释，理想状态下每个微滴中含有1 个分子的核酸模板，扩增完成后对所有的液滴进行荧光信号识别并计数，通过泊松分布原理计算靶标分子的浓度。基于分液形式的不同，dPCR 主要分为3 种：微流体数字PCR（microfluidic digital PCR，mdPCR）、液滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）和芯片数字PCR（chip digital PCR，cdPCR）。与传统的核酸扩增技术相比，dPCR 不需要内参基因，不依赖扩增阈值（cycle threshold，CT）和标准曲线，dPCR 扩增效率不影响结果，可以绝对定量核酸分子［2］。近年来，推出的最新使用指南：数字定量PCR 实验数据和发表文章所必须的最低限度标准指南（the digital MIQE guidelines：minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments，dMIQE）［3］，使dPCR 的实验方法更标准化，实验结果可靠性和准确性不断提高［4］，dPCR 技术在基因突变检测、拷贝数变异检测、病毒微生物检测、转基因食品检测以及测序等方面均得到广泛的应用［5］。

2 dPCR 技术在检验中的应用

2.1 dPCR 在肿瘤研究和诊断方面的应用

dPCR 技术具有高灵敏度、高准确性的特点，在微量样本的检测中发挥重要作用。该技术不仅能实现样本核酸的检测和定量，还能发现新的肿瘤标志物、研究核酸功能作用［6］。血液或其他体液中的循环核酸、循环肿瘤细胞DNA、微小核糖核酸等常作为检测对象。

在急性髓系白血病的诊疗中，体细胞基因突变是重要的预后标志物和治疗靶标。Rausch 等［7］研发了一种新型的ddPCR 检测设计——“double drop⁃off”（DDO⁃ddPCR），可以检测目标DNA 分子的两个相邻突变热点区域中的异质性变化，可用于突变筛选以及定量检测。实验证明，DDO⁃ddP⁃CR 检测具有较高的一致性和灵敏度，将DDO⁃ddPCR 用于检测血浆游离DNA 可以诊断急性髓系白血病，监测长期靶点特异性疗法效果，评估化疗期间的早期反应，以及确定髓外疾病患者的体细胞基因突变。但是这种方法的临床适用性还需要更大规模的前瞻性研究来验证。

在唾液冲洗液等复杂样本中检测核酸面临着“能否检测出”和“是否检测准”这两个巨大的挑战。有研究表明miRNA 的表达水平和DNA 甲基化与肿瘤的发生、发展有着密切的关系［8］。Fung等［9］利用ddPCR 技术定量检测头颈部鳞状细胞癌患者唾液冲洗液中的PAX5、EDNRB 和DCC 甲基化靶标，将未甲基化的正常DNA 浓度稀释至0.01%，降低检测浓度下限，使得背景低甲基化信号与肿瘤衍生的高甲基化信号区分开，从而提高检测灵敏度。ddPCR 为检测非靶标分子池中的有限靶标提供了更高的分辨率，这种方法还可以对目标分子进行绝对定量而不需要外部参考标准基线。有多项研究表明同时检测多种分子畸变可能对恶性肿瘤的诊断有协同作用［10⁃11］。已经证明，dPCR 可以绝对定量、简化实验，但是dPCR 同时检测多种类型的分子靶点重复性较差［12⁃13］。为了优化检测方法，Li 等［12］使用ddPCR 结合96 微孔板开发了一种可以高通量检测多个miRNAs 和DNA 甲基化生物标志物。基于微孔板的ddPCR 检测技术可以绝对、重复、高灵敏度地定量15 个miRNAs 和14 个DNA 甲基化位点。通过实验证明，微孔板ddPCR 技术使可以高通量检测并量化痰和血浆中多种分子畸变，提高肺癌的早期诊断率。以上研究表明在低靶标浓度的复杂样本中，ddPCR 在直接定量标志物方面具有明显的优势，为肿瘤研究和诊断提供了重要的技术支持。

2.2 dPCR 在产前诊断中的应用

传统的产前诊断是通过羊膜穿刺术和绒毛膜绒毛取样进行的，这种侵入式采样方法容易对胎儿造成创伤，使孕妇流产的风险增大。dPCR 可以对母体血浆中游离胎儿DNA 进行精确分析，被广泛用于非侵入性产前筛查，是一种安全、快捷、准确的产前诊断新技术［14］。

Caswell 等［15］对血浆游离DNA 样本进行ddPCR检测，以量化母体GCK 或HNF4A 变异体的等位基因，再利用Bayesian MCMC 概率分数模型结合ddPCR 数据和胎儿分数分析预测胎儿基因型。该方法与目前仅有56%～72%准确率的超声扫描法预测母系遗传单基因疾病的胎儿基因型相比，灵敏度和准确性方面有很大改进，在单胎糖尿病妊娠巨大儿的风险管理中具有很强的适用性。

近两年，基因分型技术得到了突飞猛进的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来，但是dPCR 技术却有着不可替代的地位。在80%以上的报告病例中，抗血小板HPA⁃1a 抗原是引起胎儿和新生儿同种免疫血小板减少症的原因［16］。Mammasse 等［17］利用ddPCR 技术同时扩增四种血小板抗原系统预测的胎儿HPA 基因型，所有胎儿和新生儿同种免疫性血小板减少症病例组基因型均在羊膜穿刺术或分娩后得到验证。实验结果证实，ddPCR 是一种灵敏、准确、安全、非侵入性检测方法，可以预测胎儿血小板抗原基因分型，有助于识别有风险的孕妇，加强产前管理。Vodicka 等［18］分析比较实时荧光定量PCR、微测序和ddPCR 方法在RHD 胎儿无创性基因分型中的应用，结果显示：ddPCR 的准确性与实时荧光定量PCR 相当，但是灵敏度更高；与微测序方法相比，ddPCR 仅在半个工作日内便可完成。在基因分型检测方面，ddP⁃CR 可以对母体胎儿游离DNA 的数量进行准确的测量和定量，重复性较好，从而将假阴性结果的可能性降到最低。

dPCR 检测不仅可以精准地预测基因分型，在常染色体遗传病的检测中也得到了广泛的应用。脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）在新生儿中的发病率约为1∶3 900～1∶16 000［19］。Noemi等［20］利用ddPCR 方法检测1 530 名患者干血点中运动神经元存活基因1（spinal motor neurons⁃1，SMN1）缺失和SMN2拷贝数变化，并同时测定SMN1、SMN2 和核糖核酸酶P/MRP30k Da 亚基浓度，当拷贝个体≥1 SMN1 时，批次内和批次间不确定度的变异系数<7.1%。检测12 例SMA 阳性样本的敏感性和特异性均为100%，ddPCR 方法灵敏度高、特异性强，适用于SMA 新生儿筛查和载体状态测定。

2.3 dPCR 在病毒检测和预后治疗方面的应用

病毒载量是持续性病毒感染的重要决定因素，往往与疾病的预后和复发相关。Rutsaert 等［21］分别用dPCR 和RT⁃qPCR 检测病毒载量变化，监测艾滋病疾病进展。结果显示与RT⁃qPCR 相比，dPCR 能够对核酸进行高灵敏度检测和对靶点进行直接绝对定量，可以量化持续存在的低浓度病毒。随着dPCR 技术的不断发展，它很可能成为艾滋病毒研究与诊断中不可或缺的检测工具。

准确检测出低浓度的复制残留的中间价闭合环DNA（covalently closed circular DNA，cccD⁃NA），是判断HBV 是否治愈的重点［22］。Bao 等［23］利用dPCR 技术以过量松弛环状双链DNA 为背景，精确定量肝细胞中稳定增殖的HBV cccDNA未发现假阳性。与传统PCR 方法相比，dPCR 方法最低检测浓度降低1 000 倍。dPCR 大大提高了cccDNA 检测的敏感性和特异性，可用于筛选有效的cccDNA 抑制剂。

HPV 病毒载量是病毒持久性的重要决定因素［24］，不同HPV 基因型的病毒载量检测对预测宫颈癌发生率至关重要。Malin 等［25］利用ddPCR 对福尔马林固定石蜡嵌入组织和宫颈液细胞学样本的DNA 进行病毒载量分析，比较多重HPV 感染和单发HPV 感染的肿瘤之间病毒载量的差异，结果显示ddPCR 可以高灵敏度地绝对定量不同HPV基因型的病毒载量，ddPCR 可能成为预测疾病进展或复发的有效监测工具。

早期筛查出阳性的核酸样本对于预防和控制新冠肺炎病毒感染至关重要［26］，但是，也有报道称新冠肺炎出院患者中出现了SARS⁃CoV⁃2 复发，可能是检测结果假阴性以及病毒的重新激活或再次感染。最近，有报道称与RT⁃qPCR 相比，dPCR 在检测SARS⁃CoV⁃2 低病毒载量方面显示出更高的敏感性和特异性［27］。Sun 等［28］使用dPCR 技术对临床复发的新冠肺炎患者定量检测SARS⁃CoV⁃2，分析低病毒载量标本的检测效果。结果表明，与RT⁃qPCR 相比，dPCR 对SARS⁃CoV⁃2 模拟样本和临床样本的低病毒载量具有更高的敏感性，并能准确反映病毒RNA 拷贝数的变化。与传统PCR相比，在SARS⁃CoV⁃2 复发样本和假阴性以及病毒的重新激活或再次感染样本中，dPCR 检测更具优势［29⁃30］。dPCR 对SARS⁃CoV⁃2 与其他呼吸道病原体如普通流感病毒或其他人类冠状病毒的鉴别也显示出很高的特异性。

综上所述，dPCR 具有高特异性和高灵敏度的特点，与RT⁃qPCR 相比，该技术的主要优点是定量分析精度高、可靠性强、重现性好，可实现复杂目标序列的大规模平行单分子扩增。这项技术可以在临床生物学实验室、临床检验诊断以及几乎所有学科中使用，特别适用于对低丰度的或抑制剂存在的复杂环境中的核苷酸序列定量检测。

3 小结与展望

dPCR 虽然实用性强，应用范围广，但是还存在一些局限和不足：①高灵敏度的dPCR 技术在受到外源性污染时会造成假阳性结果。②当反应分子池单元达到饱和状态时，样品浓度越高，检测精度越低，所以需要优化稀释方法，以满足对样本持续检测的能力。③相比于传统PCR，dPCR 的成本高出几十倍。④每个反应池理论上希望最多存在一个核酸模板，然而实际操作中却通常含有2 个及2 个以上的核酸模板，导致基因拷贝数的偏移。为了提高dPCR 的准确性、适用性，弥补现存的不足，应首先在实验室内进行标准质控验证，再进行实验室间的质控标准化确认。其次可以优化dPCR技术操作方法，提高对靶标检测的准确性和实验目的的适用性，如上文所述应用96 微孔板等优化操作过程，或与NGS 测序、质谱、恒温扩增技术等多种技术相结合扩展应用范围。最后，dPCR 技术还在不断完善，适用的范围也将逐渐扩大，与其他检测技术的结合将更为紧密，期望dPCR 在基础研究和应用方面发挥更大的作用。