3D 打印“生物活性支架”过程中细胞损伤的研究进展

余海洋 赵红斌 刘纯 贾中芝

【提要】 近年来，3D 打印“生物活性支架”已成为研究的热点。虽然3D 打印生物活性支架取得了巨大的进步，但在生物活性支架打印过程中，多种因素会导致细胞损伤，甚至细胞死亡，主要包括以下几种原因：①不同的打印方式产生的细胞损伤方式及损伤的程度各不相同，如热损伤、挤压损伤、剪切和拉伸应力损伤等；②接收基板是否有涂层，以及涂层的厚度和原材料种类等。接收基板的涂层可以起到细胞培养液和碰撞缓冲的双重作用，会对细胞损伤产生一定程度的影响，细胞损伤的程度直接影响了3D 打印生物活性支架的生物活性。本文对生物活性支架打印过程中的细胞损伤的研究进展进行综述。

3D 打印“生物活性支架”是使用活细胞与支架材料混合成“生物墨水”，然后通过3D 打印的方式获得生物活性支架，如皮肤支架、骨支架、软骨支架等[1-4]。随着3D 打印技术和材料学的快速发展，3D 打印生物活性支架取得了巨大的进步[5]，但在3D 打印过程中，细胞将承受挤压、高温及碰撞等多重因素作用，如果损伤超越细胞承受能力，就会引起细胞的死亡[6]。因此，如何降低3D 打印过程中对细胞的损伤，维持细胞的活性，是目前3D 打印“生物活性支架”过程中的热点和难点[7]。

在生物活性支架的3D 打印过程中，有多种因素会导致细胞损伤，甚至导致细胞死亡[8]。本文对生物活性支架3D 打印过程中细胞损伤研究的进展进行综述。

1 3D 打印方式对细胞损伤的影响

目前，适用于生物活性支架的3D 打印方式主要有挤压式3D 生物打印、喷墨3D 生物打印、激光辅助3D 生物打印和声控3D 生物打印。其工作原理各不相同，但在生物活性支架3D 打印过程中，均会对活细胞产生一定的损伤。

1.1 挤压式3D 生物打印

挤压式3D 生物打印是以机械力或气压等为驱动力，从喷头挤压出“生物墨水”，从而构建生物活性支架。该方式打印速度较快，有利于控制支架的孔隙结构和细胞的密度，适用于高黏度和高细胞密度的生物墨水打印。该技术在墨水材料种类、生物相容性、三维成型能力等方面具有综合优势，是使用最为广泛的生物活性支架打印方式[9]。

挤压式3D 生物打印的压力驱动会导致细胞损伤，甚至细胞死亡[10]。打印过程中，生物墨水从墨水仓被挤压至喷嘴、平台，管道内壁会对生物墨水产生一定的剪切力[11]。这种印刷机制会使细胞承受持续的剪切力和拉伸应力，从而导致细胞膜破裂和细胞受损，且细胞损伤程度与剪切力的大小相关[12]。通常情况下，剪切力与距管道内壁的距离呈负相关；另外，生物墨水的黏度、挤压力的大小、喷嘴的内径也直接影响剪切力的强度，从而影响细胞的损伤程度[13]。有研究发现，挤压式3D 生物打印墨水的温度对细胞的损伤也有一定的影响[14]。

因此，剪切力是挤压式3D 生物打印过程中导致细胞损伤的关键因素。在挤压式生物打印过程中，如何在保持细胞活性（降低细胞损伤）和打印速度的同时，又能降低压力并减小喷嘴尺寸是该打印方式的主要研究内容。此外，3D 生物打印过程中控制好生物墨水的黏度（不宜过高或过低），寻找合适的黏弹性区间，也是实现良好3D 生物打印的重要步骤。

1.2 喷墨生物打印

喷墨生物打印是通过使用计算机控制，然后将生物墨水以液滴的形式精确打印在接收基板上，然后利用紫外光层固化，最终获得3D 生物活性支架[15]。该打印方式获得的3D 生物活性支架内的细胞活性比较高，而且成本相对较低，但无法打印黏度较高的生物墨水，并且细胞在培养液中的分散程度也很难控制，且打印效率较低[16]。

喷墨打印主要采用微热泡或压电驱动器喷射液滴来实现生物活性支架的3D 打印。热气泡的产生和压电的变形会对细胞造成一定的损伤，因此控制打印工艺参数是降低细胞损伤的关键因素[17]。热喷墨打印时，加热元件迅速达到高温，使喷嘴处的生物墨水形成气泡，气泡就会产生压力使一定量的生物墨水液滴克服表面张力被挤压出孔口，然后从孔口喷射出来，喷嘴的最高温度在300 ℃以上，极易造成生物墨水中细胞的热损伤；另外，在气泡形成与喷射过程中，生物墨水中的细胞还会受到挤压损伤[15]。反之，压电驱动器喷射方法，打印脉冲在10～25 μs 时，细胞的存活率高达96%，表明压电喷射对细胞的损伤较微热泡驱动方式小[18]。

喷墨打印的喷射速度不同，产生的剪切应力也不同，导致的细胞损伤程度也不同[19]。当喷射速度为5～8 m/s 时，细胞受到的剪切应力的数值比较稳定，当喷射速度达到10 m/s时，细胞受到的剪切应力增幅逐渐变大，尤其是在40 m/s 之后，细胞受到的剪切应力增长越来越快[17]。还有研究表明，适当增加打印时间的间隔，也可以有效减少细胞在着落过程中的受力，从而降低细胞的机械性损伤[17]。

1.3 激光辅助生物打印

基于激光诱导正向移动的技术，利用聚焦激光脉冲产生的高压气泡，将生物墨水推向接受基板，从而构建生物活性支架。该打印技术在维持细胞活性的同时，实现了生物墨水的精确和高分辨率3D 打印，常用于高黏度的生物墨水和含有高浓度细胞的3D 生物打印，但是成本相对高，效率较低，且不利于多种细胞的混合生物打印[20-21]。

通过激光束使局部产生高温，进而使细胞悬浮液气化并产生气泡，最后喷射出细胞液滴，该过程中细胞同样会受到一定程度的热损伤[18]。另外，其喷射速度高（50～1 000 m/s），喷射时细胞承受的压力大（8～15 MPa），在细胞着落在接受基板上时，细胞与接收基板的物理碰撞会导致细胞剪切损伤（如细胞膜破裂等），甚至细胞死亡[23]。研究发现，细胞损伤程度随着激光能量密度的增加而增大（85～1 500 MJ/cm2）[23]；即使对于耐受力较强的酵母细胞，仍有10%～55%的细胞在喷射后发生死亡[23]。

1.4 声控生物打印

采用表面声波控制，在压电基板上周期性排列着一系列的声控发生器，由圆形的传感器组成，并组成二维阵列，同时需要打印的细胞悬浮液在压电基体上。由于传感器产生的声波是圆形的，这些声音就会在细胞悬浮液表面形成焦点，当焦点处的声压超过液体表面张力时，在空气与液滴的接口处就会产生声控打印液滴。在打印过程中，虽然细胞液滴不会受到高温、高压的影响，但是在打印含单细胞液滴时，该技术有时会打印出不含细胞的液滴，其在打印单细胞时的可靠性较弱，重复性较差。

研究表明，细胞在声控生物打印后的存活率高达89.9%[24-25]，可见该打印方式对细胞的损伤程度较小，但该打印方式损伤细胞的机制尚不清楚，仍需深入研究。

2 接收基板对细胞损伤的影响

接收基板的作用是接受被打印的细胞、承载构建的生物活性支架。接收基板上是否有涂层、涂层的厚度以及涂层的原材料，均会对细胞损伤产生一定的影响。目前，最常用的涂层是水凝胶，水凝胶可以起到细胞培养液和碰撞缓冲剂的双重作用[26-27]。

2.1 接收基板的涂层及其厚度

对于高速3D 生物打印技术，接收基板有无涂层材料及其涂层材料的厚度均对细胞的受力有一定的影响[17]。在激光辅助生物打印过程中，使用不加涂层的石英接收基板，只能获得5%的细胞存活率，当在基板上涂抹了20 μm 的水凝胶时，细胞的存活率就提高到了50%，水凝胶的涂层为40 μm时，细胞的存活率就提高到了95%[27]。研究发现，当接收基板上没有任何涂层时，即接收基板上无缓冲/培养物质，生物墨水中的细胞被打印到接收基板时承受的应力和剪切应力均为最大；当接收基板涂有水凝胶时，生物墨水中的细胞被打印到接收基板时承受的应力和剪切应力变小，且随着水凝胶涂层厚度的增加，应力和剪切应力均逐渐减小，即使接收基板上只涂一层薄薄的水凝胶（20 μm），都可以显著降低生物墨水中细胞承受的应力和剪切应力，降低细胞机械损伤的程度[18]。因此，接收基板上的涂层及其厚度均直接或间接影响细胞的损伤程度。

2.2 接收基板涂层的原材料

接收基板涂层的原材料对细胞的损伤也有一定的影响。在相同的3D 打印条件下，当接收基板的涂层为液态培养液时，细胞的存活率为93%，而接收基板的涂层为半固态琼脂培养基时，细胞的存活率增加至96%[18]。因此，接收基板涂层原材料的性质也在一定程度上影响细胞的损伤。

3 结论

在生物活性支架打印过程中，多种因素会导致细胞损伤，不同的打印方式引起的细胞损伤程度各不相同，如热损伤、挤压损伤、剪切和拉伸应力损伤等；接收基板是否有涂层以及涂层的厚度和原材料种类等。在生物活性支架打印过程中，如何减少细胞损伤，仍需要进一步对打印方式、打印参数、细胞着落过程中的受力情况等展开深入的研究。