促进间充质干细胞外囊泡产生的研究进展

郑毅 许鹏 刘凯

【提要】 细胞外囊泡（EVs）治疗是一种前景广阔的临床治疗方法，可以规避间充质干细胞（MSCs）治疗的多种潜在风险。但基于治疗目的需要大量EVs，而EVs 的产量较低难以满足需求，需要开发促进EVs 产生的方法。本文围绕近年来促进EVs 产生的新方法与进展进行介绍，为实现EVs 的高效、大量生产并应用于再生医学治疗领域提供参考。

近20 年来，间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）在再生医学领域越来越受到关注，应用于临床的MSCs包括骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）、脂肪来源间充质干细胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）、脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cell，HUC-MSCs）等。MSCs 具有自我更新能力，可以分化成多种细胞谱系，并且可以分泌多种生长因子，表现出强大的再生潜能。研究发现，局部应用ADSCs 可以加速伤口愈合、促进骨关节炎恢复[1-2]。然而，最近的研究表明，MSCs 并非通过分化成其他细胞来修复受损组织，而是通过其介导的旁分泌机制[3]，如细胞因子以及细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）等，来调控受损的细胞[4-5]，而EVs 是MSCs 发挥组织修复与再生效应的关键产物之一[6]。

相较于MSCs，EVs 在临床应用中具有诸多优势。多项动物研究表明，EVs 可以减少心肌梗死面积[7]、减轻肝脏损伤[8]、改善受损的肾功能[9]、促进卒中恢复[10]与皮肤创面愈合[11]等。还有研究者将EVs 用于COVID-19 的治疗[12]。此外，EVs 可作为疾病诊断的标志物[13]，或作为天然来源的生物载体实现药物递送与释放[14]。基于再生治疗目的，EVs 的生产需要培养大量的MSCs。然而，细胞分泌EVs 的产量过低，难以达到治疗的需求。例如，啮齿动物模型所需的EVs 相当于48 h 内从200 万个MSCs 收集的EVs 数量[15]，而按照比例，应用于人体的治疗量可能需要数亿细胞来生产[16]。因此，有必要研究新的方法来促进EVs 的产生。目前的研究主要聚焦在如下几个方面：第一，提高单位数量细胞释放EVs 的数量。通过对细胞进行物理或化学等外源性刺激，可以促进EVs 的产生[17]。第二，通过各种立体培养方法增加培养空间中细胞的数量，从而提高获取EVs 的效率，并减少每个细胞所需的培养基体积。第三，解决目前分离方法效率低、提取的EVs 易受破损等问题[18]，从而提高EVs 的分离效率。本文将围绕近年来促进EVs产生的新方法与进展进行介绍，为实现EVs 高效、大量生产并应用于再生医学治疗领域提供参考。

1 外源性刺激促进细胞释放EVs

1.1 血清剥夺

血清剥夺是最常用，简单的促进MSCs 释放EVs 的外源性刺激方法[19]。Li 等[20]发现，使用血清剥夺培养基与含10%无EVs 血清的培养基，培养小鼠神经母细胞瘤细胞系（Neuro2a）和富含运动神经元的胚胎小鼠脊髓细胞与小鼠神经母细胞瘤的融合体（NSC-34），48 h 后，血清剥夺培养基的EVs 产量始终高于10%无EVs 血清的培养基的产量。Bost 等[21]的进一步研究表明，在培养基中添加血清培养人胚胎肾293 细胞（Human embryonic kidney 293 cell line，HEK-293）的衍生株HEK-293T 细胞，不利于细胞EVs 的释放。为了探究哪些成分会影响细胞EVs 释放，通过提取出血清中的EVs 与白蛋白等大分子物质单独作用于细胞，发现细胞EVs 的产生受到抑制。对血清剥夺培养与10%血清培养的HEK-293T 细胞转录的分析表明，血清剥夺培养使细胞的神经酰胺转录水平明显增加，而使用神经酰胺抑制剂GW4869 处理细胞可显著降低血清剥夺培养细胞EVs 的产生，提示神经酰胺依赖性的EVs发生途径是血清剥夺促进EVs 释放的关键机制。然而，血清剥夺过久的细胞常表现出不良的生长状态，无法持续性地生产EVs。但因其操作简单易行，大量的研究仍在提取EVs 前对细胞进行血清剥夺处理[20]。

1.2 低氧

低氧刺激也是促进细胞释放EVs 的一种较常见的方法。多项研究表明，1%或0.1%的低氧条件可以促进乳腺癌细胞分泌EVs[22]；0.5%的低氧条件可以促进骨髓干细胞分泌EVs。低氧状态下，低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达升高，进一步激活下游靶标nSMase2，而nSMase2 是EVs 生物发生与释放的关键因子之一，提示低氧可能是通过HIF-1α 与nSMase2 的一系列通路的激活，促进了细胞分泌EVs[23]。低氧还可影响并改变多种细胞基因的表达，如葡萄糖转运蛋白（GLUT-1）、表皮生长因子受体（EGFR）等，从而增加这些受体的激活或导致受体聚集，进一步诱导内吞作用并促进EVs释放[24]。低氧不仅能促进EVs 的释放，经过低氧刺激后细胞分泌的EVs 具有更强的促进血管生成、促进脂肪移植物成活、促进糖尿病创面恢复[25-27]等生物学效应。

1.3 pH 改变

Ban 等[28]发现，相比中性培养基，将HEK-293 细胞在酸性培养基中孵育30 min，其分泌的EVs 内容物中蛋白和核酸的浓度显著增加，EVs 的标志物CD9、CD63 和HSP70 明显增多；而碱性培养基中未发生明显改变。Parolini 等[29]观察到酸性微环境可以促进黑色素瘤细胞EVs 的释放与摄取。Nakase等[30]的研究表明，低pH 培养Hela 细胞可能通过影响MVB的胞吐来影响EVs 的释放；低pH 会改变Hela 细胞分泌的EVs 相关性状，包括其蛋白含量、zeta 电位等，而这些改变可能影响了Hela 细胞对EVs 的再摄入，从而增加了EVs 在上清液中的数量，但其确切的机制仍不清楚。此外，低pH 促进细胞分泌EVs 是否对所有细胞具有普适性，以及针对不同的细胞何种pH 条件最适宜等问题仍需进一步研究。

1.4 机械应力

大量研究表明，机械应力的变化能够改变细胞，影响其分化和转归。例如，压力可以促进MSCs 向软骨分化，促进软骨细胞的生长与细胞外基质表达[31]。最近的研究将生物反应器模拟体内的机械力与液体剪切力，发现这些刺激可以促进细胞分泌EVs。Patel 等[32]构建了一种3D 灌注生物反应器系统，可以模拟生理状态下血流动力学应力。培养3 d 后，人真皮微血管内皮细胞（Human dermal microvascular endothelial cells，HDMEC）分泌EVs 的产量相比静态培养增加了100 倍以上，EVs的CD63 的表达增加了14 倍。Guo 等[33]设计了一种具备拉伸收缩功能的灌注生物反应器，培养体内来源的干细胞，发现细胞分泌的EVs 产量明显增加。机械应力可以增加细胞内机械敏感性YAP 蛋白的表达，该蛋白在细胞核中的积累可以进一步激活Wnt 通路，Wnt 通路的激活可以促进细胞释放EVs[34]。

1.5 电刺激

电刺激具有多种生理学功能，生物体内的电刺激可以刺激组织的发育与再生，促进细胞分泌多种细胞因子，也能促进软骨分化与成熟等[35]。Fukuta 等[36]的研究表明，低水平的电刺激（0.3～0.5 mA·cm-2）可以通过影响鼠黑色素瘤细胞系（B16F1）与鼠成纤维细胞系（3T3 Swiss Albino）中的Rho GTPase 蛋白、Rab 家族蛋白与细胞内钙离子水平来增加内吞与EVs 释放，提高EVs 产量。另外，较强的瞬时电刺激可导致细胞膜穿孔，虽然瞬时电刺激常用于转染质粒DNA 或特定药物，但该方式也可以使EVs 的释放增加数十倍[37]。因此，电刺激理论上可以在促进EVs 分泌的同时，转入需要的治疗药物，实现靶向且高效的EVs 生产。

1.6 细胞因子与化学药物

EVs 的产量也可以通过使用一些细胞因子与化学药物来提高。例如，部分抗炎类药物（乙酰水杨酸、塞来昔布和氯喹等）可以促进细胞分泌EVs[38]。将特定细胞（如中性粒细胞）与细胞因子使用TNF-α 孵育，可以促进EVs 的分泌。这些细胞因子与化学药物可以影响细胞的肌动蛋白功能与细胞膜流动性，还可以改变细胞内钙离子浓度，从而影响EVs 的释放[39]。但由于引入了外来化学药物或试剂，可能对EVs 的成分与纯度造成影响，是否可以应用于EVs 的大量生产仍有待进一步研究。

1.7 其他

Chen 等[40]发现，热应激处理后，肿瘤细胞分泌的EVs 明显增加。Bagheri 等[41]使用80 J·cm-2功率强度的低强度激光（Low-level laser irradiation，LLLI）照射，可以通过诱导脐静脉内皮细胞发生自噬，并促进细胞内Wnt 信号通路的激活和GTPase 的转录来增加EVs 的分泌。目前，许多方法仍停留在理论阶段，在未来的转化应用中，仍需探讨其机制与原理，并尝试构建标准化的生产流程。

2 提高细胞培养效率

3D 培养是提高细胞培养效率最常用的方法，可在有限的细胞培养空间内，扩展细胞培养的数量。最早提出的3D 生物反应器是2008 年Integra CELLine 的“烧瓶”生物反应器[42]，可使培养的间皮瘤细胞的EVs 产量提升12 倍，且EVs 的形态、表型和免疫功能与对照组类似。随后，更多种类的3D 生物反应器被开发应用。Patel 等[32]构建了多层支架结构的3D生物反应器，在增大培养面积的同时模拟体内的流体剪切力，明显促进了EVs 产生。3D 生物反应器通过内置的传感器，还可实现自动化的微环境控制，可以更好地进行营养物质的循环，以及对O2、CO2 和温度的控制[43]。

最近，以中空纤维为代表的新型3D 生物反应器逐渐成为研究的热点。中空纤维生物反应器有别于传统的培养瓶，是一种在封闭系统内将细胞区域与培养基区域分隔开来的三维反应器。由于中空纤维的特殊性，细胞可以在系统中长时间保持良好形态而无需传代；中空纤维可以在单位空间内培养大量细胞，并将EVs 富集在外部隔室的培养基内，同时半透膜避免了内隔室细胞培养基中血清来源EVs 的污染[44]，具有独特的优势。

3 改善EVs 的提取方法

随着分离提纯技术的快速发展，目前已经有许多提取EVs 的方法。这些方法基于EVs 不同的特性（如密度、形状、大小和表面蛋白等）来进行分离，每种技术各有优劣。

差速离心法是目前最常用的EVs 提取方法[45]。然而，杂质蛋白的混杂可能会影响其应用及成分分析[46]。此外，较大的离心力可能对EVs 的结构产生不良的影响[18]；每次离心体积较小，离心时间较长，限制了该方法在大规模提取EVs 中的应用。

超滤法是基于膜过滤的一种分离方法，操作简便[47]。但是，超滤时的压力可能导致EVs 破裂，影响其生理学功能与成分[48]。此外，囊泡在膜上大量堆积与吸附，会导致膜的堵塞与产量损失[49]。其中，尺寸排阻色谱法基于重力作用，可以保持EVs 的结构与原有生物活性[50]，但其能处理的样本体积有限；基于免疫结合原理的有免疫吸附法[51]，但产量低成本高[45]；基于亲疏水原理的共沉淀法[52]，产量较高[53]，但可导致其他杂质的共沉淀[54]，引入的外来化学物质不利于EVs 的临床应用。

最近，一种新的基于微流体膜过滤的方法（TFF）使EVs的分离提取技术得到进一步发展[55]。TFF 的原理与超滤法类似，但超滤法的直流过滤易导致靠近膜表面的液体颗粒积聚，引起膜阻塞并降低过滤效率，最终导致膜破裂[56-57]。TFF引入了切向流分量，防止颗粒在膜表面形成高浓度液层，可以使过滤效率保持稳定，避免以上问题的产生。将TFF 与其他EVs 分离提纯的方法结合，可以显著提高EVs 的产量并减少损失。Nordin 等[58]开发了一种TFF 结合尺寸排阻色谱的提取方法，可收获高达50%～80%的EVs（理论产量）。Haraszti 等[59]联合使用微载体3D 培养方法与TFF 提纯方法，总体使EVs产量提高了140 倍。Kim 等[60]开发了一种完全封闭的双循环TFF 芯片（dcTFF），可收获所需粒径区间的EVs。尽管TFF 同样难以分离与EVs 粒径相似的杂质，但TFF 可以处理大体积（＞1 L）的样本，非常适合用于大量生产EVs；此外，由于保持了过滤效率的稳定性，TFF 提高了批次间的一致性[61]。因此，TFF 可能是未来更适合临床使用的EVs 提取方法之一。当然，TFF 设备仍需要进一步发展，其可扩展性、验证方法和标准化等问题仍有待进一步解决与完善。

4 总结与展望

过去的数年间，随着EVs 研究的发展与深入，其在再生治疗中的优势正逐渐显现出来，而基于治疗目的，需要高效、大量地生产EVs。为了克服EVs 产量低的问题，已经有多种策略用于促进EVs 的产生。虽然许多方法仍处于理论阶段，或仅局限于特定的细胞或应用场景，但随着研究的进一步发展，距离高效、大量地生产EVs 的目标将更加接近。在今后的研究中，需要探究EVs 生产方法对EVs 质量与生物学效应的影响，摸索与建立EVs 产生的流程与标准，满足未来再生医学的临床需求。