NASH患者外周血单个核细胞TXNIP/NLRP3水平变化及其临床意义探讨*

张 斌，王依屹，石 磊

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)又被称为代谢性脂肪性肝炎，其为肝组织病理学变化与酒精性肝炎相似而无过量饮酒史的一种临床综合征，好发于中年，尤其是超重肥胖人群，以肝细胞大泡性脂肪变伴肝细胞损伤和炎症等为主要特征，严重者将进展为肝纤维化，甚至肝硬化，严重危害患者身体健康[1，2]。及时对NASH患者疾病转归进行预测是改善其治疗结局和预后的关键。目前，临床对NASH病机尚未完全明确，临床尚缺乏特异性的诊断指标[3]。有研究指出，炎症反应和炎性损伤是诱发NASH 发生发展的最主要的原因[4，5]。硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)是体内重要的抗氧化蛋白，其能通过抑制TRX介导氧化应激反应，并诱导细胞凋亡，与NASH发病可能相关[6]。NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3(NLRP3)参与组成的炎症小体是细胞质中的一种大分子复合蛋白，实验研究发现NLRP3基因敲除对改善NASH小鼠肝损伤和脂代谢有明确的保护作用[7]。本研究探讨了NASH患者外周血TXNIP/NLRP3水平变化及其临床意义，旨在为有效诊治NASH患者提供更多的参考依据。

1 资料与方法

1.1 病例来源 2019年1月～2021年1月我院收治的NASH患者150例，男85例，女65例；年龄为33～65岁，平均年龄为(44.21±7.32)岁。符合《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》[8]关于NASH的诊断标准，入院前未接受过任何药物治疗。排除标准：病毒性肝炎或药物性肝损伤；应用过免疫抑制剂或抗生素类药物；凝血功能障碍；严重的感染性或血液性疾病；严重的精神障碍；妊娠或哺乳期妇女。另选择同期在本院体检的单纯性脂肪肝患者45例，男29例，女16例；年龄为35～68岁，平均年龄为(45.04±6.98)岁。两组年龄和性别比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。受试者签署书面知情同意书，本研究经我院医学伦理委员会审核、通过。

1.2 肝穿刺活检 常规进行肝穿刺活检。根据肝组织病理学检查结果[9]将NASH患者分为轻度(不合并或仅有轻度的纤维化)、中度(合并显著的肝纤维化或间隔纤维化)和重度(合并肝硬化)。随访12个月，再次行肝穿刺活检，判断疾病转归(进展，为轻度者进展为中度或重度，或中度者进展为重度，或肝硬化进展，和无进展，各病变程度维持原状或改善)。

1.3 外周血单个核细胞(PBMC)TXNIP/NLRP3水平检测 取干净试管，加Ficoll分离液6 mL，加肝素抗凝。沿管壁用滴管将混悬液缓慢滴加至分层液上层，377 g离心15 min，采集上、中层界面白色云雾层细胞，移至含5 mL细胞洗涤液试管中，混匀后107 g离心20 min，反复洗涤沉淀，得到PBMCs，4℃冷藏备用。按照TRIzol试剂说明书提取细胞总RNA，在紫外分光光度计上检测并记录总RNA浓度和纯度。将总RNA逆转录为cDNA。取cDNA，建立20μL反应体系，根据qRT-PCR试剂盒说明书进行qRT-PCR。以2-△△Ct表示目的基因与对照基因表达的倍数。引物序列：TXNIP，上游TGGCTGTAACATTCGGAGATTGTGG，下游GCTTCTGGTTGCTGCTGCTGCGGAC；NLRP3，上游AATTGGCAGCAGATCAGGTCTAAGC，下游CATGTCATCTAGCAGAGGAGTGGTTG；β-action参照物，上游CATGTACGTTGCTATCCAGGC，下游CTCCTTAATGTCACGCACGAT。

1.4 血生化检测 常规进行。

2 结果

2.1 两组血生化指标比较 NASH组血清ALT和AST水平显著高于单纯性脂肪肝组(P<0.05，表1)。

表1 两组血生化指标比较

2.2 两组PBMCs TXNIP/NLRP3水平比较 NASH组PBMCs TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值显著高于单纯性脂肪肝组(P<0.05，表2)。

表2 两组比较

2.3 不同病情NASH患者血生化指标和PBMCs TXNIP/NLRP3水平比较 在150例NASH患者中，经组织病理学检查，诊断轻度49例，中度68例和重度33例；重度组血清ALT、AST及PBMCs TXNIP mRNA、NLRP3 Mrna和TXNIP/NLRP3比值显著高于轻度组或中度组，而中度组也显著高于轻度组(P<0.05，表3)。

表3 不同病情NASH患者血生化和PBMCs TXNIP/NLRP3水平比较

2.4 不同疾病转归NASH患者PBMCs TXNIP/NLRP3水平比较 经二次肝穿随访，在150例NASH患者中，发现疾病进展31例，无进展119例；进展组PBMCs TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值显著高于无进展组(P<0.05，表4)。

表4 不同疾病转归NASH患者PBMCs TXNIP/NLRP3水平比较

3 讨论

NASH是一种多系统疾病，不仅影响患者肝脏组织结构和功能，且会增加心脑血管疾病、慢性肾病和肿瘤的发病风险。NASH的流行给人们生命健康及社会经济生活带来了沉重的负担[10]。目前，对NASH病机尚未完全明确，主要涉及“脂质代谢失衡”、“胰岛素抵抗”、“炎症反应”等机制。研究指出，NASH发病与炎症反应和胰岛素抵抗有关[11，12]。有动物实验研究表明NASH病情严重程度与脂质代谢失衡相关[13]。近期有报道指出“炎症小体激活”可能是初始代谢应激和肝纤维化甚至是肝细胞死亡的重要原因。TXNIP/NLRP3水平是反映机体炎症小体激活的重要标志物[14]，而本研究通过检测NASH患者外周血单个核细胞TXNIP/NLRP3水平变化，分析了它们与疾病病情程度和是否进展的关系，有望为NASH病情评估和疾病转归的预测提供更多的参考依据。

本研究结果显示，NASH组肝功能指标及PBMC TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值显著高于单纯性脂肪肝患者，提示NASH患者存在明显的肝功能损害，外周血细胞TXNIP/NLRP3水平呈明显的高水平。NASH患者因脂肪摄入过多和脂肪代谢的异常或运动减少，导致脂肪沉积于肝脏，引发对肝细胞压迫或严重脂肪变损伤。因此，NASH患者存在明显的肝功能损害[15]。目前，对NASH病机的研究尚未完全明确，其中炎症小体激活被视为是NASH发病的一个重要机制。动物实验研究证实NLRP3炎性小体功能丧失的小鼠经高脂饮食诱导后并不会形成NASH[16]。另有报道指出，TXNIP分子通过增加TXNIP mRNA表达而加重机体炎性反应[17]，这也是NASH患者外周血单个核细胞TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值较单纯性脂肪肝群体明显增高的主要原因。本研究结果还显示轻度、中度、重度NASH患者血清ALT和AST水平，PBMC TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值依次明显增高，提示随着NASH患者病情加重肝功能损害越严重，同时患者PBMC TXNIP/NLRP3水平也越高。NASH患者在肝细胞损伤及胆汁淤积等多种因素作用下，出现肝实质细胞脂肪变、细胞坏死和炎症反应，使得在胶原合成增加的同时其分解减少，同时激活人体免疫系统，引起T淋巴细胞亚群的改变，导致机体炎症因子的分泌紊乱，且这种紊乱随着患者病情程度加重而更为明显[18]。NASH患者存在持续的肝脏创伤和修复过程，易引起肝脏代谢紊乱，并且易致血脂蓄积，导致肝细胞出现不同程度的脂肪变性、细胞坏死，使得肝细胞外基质过度沉积。同时NASH发作后肝细胞脂肪变性加重，从而激发机体的炎症反应[19]，而随着患者病情程度的加重，表现为更为明显的肝功能损害和外周血单个核细胞TXNIP/NLRP3水平的增高。

如果NASH患者诊治不及时易进展为肝纤维化或肝硬化。因此，NASH患者疾病转归是目前临床重点关注的项目。尽管上述研究均明确了NASH患者病情程度与血液指标的关联。TXNIP/NLRP3炎症小体与多种疾病的发生密切相关。早前主要报道在视网膜神经退行性疾病、急性肝损伤、帕金森病等疾病患者有过研究报道，近期有报道指出TXNIP/NLRP3炎症小体参与慢性阻塞性肺病患者机体炎症反应过程[20]。本研究结果显示进展期NASH患者PBMC TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值较无进展组明显升高，提示NASH患者外周血单个核细胞TXNIP/NLRP3水平与肝功能和病情严重程度密切相关。外周血单个核细胞TXNIP/NLRP3水平可能通过加重机体炎症反应而促进NASH患者病情进展。积极监测患者TXNIP/NLRP3水平对NASH病情评估有一定的指导意义。

综上所述，NASH患者外周血单个核细胞TXNIP/NLRP3水平与疾病严重程度和转归密切相关。积极监测患者PBMC TXNIP/NLRP3水平对病情评估和疾病转归预测都有重要的指导意义。但本研究同时存在样本量小和随访时间短等不足，数据的同质性和异质性尚需进一步研究证实，未来还需延长随访时间和观察。