箱线图在山梨酸定量测定能力验证结果 分析中的应用

◎ 姚泽平，黎佩锦，蔡若纯，蔡海华，林腾奕，刘小玉

（广东省食品检验所，广东 广州 510435）

箱线图，又称箱图、箱形图、箱丝图、盒须图和盒式图，是一种直接表现变量分布情况的统计模型图形，利用它可以以较为直观的视角观察数据的分布情况，箱线图对于显示变量的分布情况并确定离群值的位置非常有用[1-2]。箱线图技术是将数据集以四分位数的形式拆分，通过找到中位数的上四分位数、下四分位数以剔除数据集中的异常值[3]。箱线图中的中位数、四分位间距是箱线图用来显示数据中心和分布的元素[4]。除了箱线图，检验样本数据中异常离群值的常用方法还有3σ法、格拉布斯法等。相比之下，箱线图可以应用于正态分布样本数据异常值判断，也可以应用于非正态分布样本数据异常值判断。因此，箱线图在统计分析中已得到广泛应用，THIRUMALAI等[5]应用箱线图分析肺癌数据；代斌[6]应用箱线图法的PSO-SVM研究小麦种子的分类；LIN等[7]应用箱线图挖掘RBM8A在肝细胞癌中的表达及基因调控网络；赵颖祺等[8]提出一种基于箱线图的SAR图像舰船研究的检测算法；谷剑芳[9]应用LSTM、RFM算法和箱型图探讨了电子社保卡在互联网中的行为。

山梨酸是一种食品添加剂，是目前在国际上使用较为广泛的防腐剂。它有较强的抑菌作用，能够阻止真菌的繁殖生长。山梨酸具有抑制微生物内部脱氢酶系统的特性，通过抑制脱氢酶系统阻止微生物的生长繁殖，从而起到防腐的作用，常在药品、化妆品、动物饲料、橡胶助剂以及包装材料中得到应用[10-11]。我国GB 2760—2014对不同类别食品中山梨酸的限量作出了明确规定[12]。

能力验证是一种通过实验室间的比对，按照标准准则评估参与者能力的活动[13]。能力验证活动可评估实验室特定的检验测量能力，进一步发现实验室存在的不足，建立检验方法的可比性和有效性，促进实验室提升检验测量质量，有助于所参与实验室提高检测能力[14]。因此，参加能力验证项目的结果值能反映实验室的检测水平。在能力验证活动中，参与机构除了具有一定的检验检测水平，对于检验结果的分析确定也应值得重视。

为进一步提高实验室对食品中山梨酸的定量测定检测水平，实行实验室内部质量控制计划，本实验室参加了2020年度FAPAS 20172“巧克力蛋糕中的山梨酸”能力验证活动，通过建立一种箱线图分析流程图，确定样品中山梨酸含量值。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

甲醇（HPLC，4 L，默克）、乙酸铵（HPLC，500 g/瓶， FISHER）、实验用水（电导率为0.55 µS·cm-1，25 ℃，均通过Milli-Q超纯水机制备）、亚铁氰化钾（分析纯，500 g，广试）、乙酸锌（分析纯，500 g，广试）；标准物质：山梨酸标准品（CAS：110-44-1，500 mg，CATO）；色 谱柱：Waters XBridge C18，250 mm×4.6 mm，5 μm。

1.2 仪器与设备

万分之一电子天平（瑞士梅特勒LE303E）；10 mL容量瓶（天玻，A级）；50 mL容量瓶（天玻，A级）；100 mL容量瓶（天玻，A级）；Milli-Q Advantage A10型超纯水机（德国Merck公司）；超声系统（东莞市科桥超声波设备有限公司）；高效液相色谱仪（美国沃特世ACQUITY ARC）；移液器（100 µL、1 mL、5 mL）。

1.3 实验方法

1.3.1 箱线图分析流程的建立

在能力验证活动中，能力验证提供者可采用经典的统计方法来确定能力验证样品的标准值和标准差。能力验证提供者可采用格拉布斯准则来剔除离群值后计算样本的均值和标准差，以均值作为标准值，以标准差作为能力评定标准差；也可以采用稳健统计方法。稳健统计方法在能力验证实际活动中应用更加广泛，更加灵活，不需要剔除样本数据中的离群值[15-16]。而对于能力验证活动参加者，能力验证样品的含量值如何确定却没有相关的标准文献。能力验证参加者在实际能力验证活动过程中，往往采用多种质控措施，如人员比对、仪器比对、方法比对、质控样试验和加标回收等[17]，以提高实验数据的准确性，这样可得到多组实验原始数据。然而，质控样试验、加标回收率，变异系数等指标，对组内数据中是否存在异常值并不敏感。因此，可从整体考虑分析所有数据，运用箱线图寻找剔除数据样本中的离群值，减少结果的偏离程度。最后根据样本数据的分布类型选择合适的集中趋势特征值作为含量值。箱线图具体分析流程如图1所示。

图1 箱线图分析流程图

1.3.2 溶液的配制

（1）乙酸铵溶液（0.02 mol·L-1）配制。准确称取乙酸铵1.54 g于烧杯中，加入适量水溶解后转移定容至1 L，经0.22 µm微孔滤膜过滤后备用。

（2）山梨酸标准储备溶液（1 000 mg·L-1）配制。准确称取山梨酸标准品0.100 g（精确至0.000 1 g），用水溶解定容至100 mL容量瓶中，于4 ℃贮存。

1.3.3 样品前处理

准确称量约2 g（精确到0.001 g）试样于50 mL离心管中，加入超纯水约25 mL，充分涡旋，混合均匀，置于50 ℃水浴中超声20 min，冷却至室温，依次加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各2 mL，摇匀，离心5 min， 将水相转移至50 mL容量瓶中，于离心管残渣中加入20 mL超纯水，重复提取一次后将水相转移至同一 50 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀。吸取适量上清液，0.22 µm滤膜过滤，滤液待液相色谱测定。

1.3.4 标准曲线浓度范围和样品稀释倍数

20172样品进行预实验，用GB/T 5009.28—2016（第一法）测得样品的山梨酸含量水平在700～900 mg·kg-1， 其仪器读取浓度在28～36 mg·L-1。再结合加标浓度考虑，样品溶液最大浓度可到75 mg·L-1。故标准系列浓度为1.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、 50.0 mg·L-1和100.0 mg·L-1。

1.3.5 质量控制措施

为进一步提高实验数据的准确性，本次参加的能力验证活动，根据20172 试样的山梨酸的含量水平、实验仪器、方法选择以及本实验室的条件，对山梨酸的含量测定使用以下质量控制措施，即平行实验、加标回收实验、质控样品实验、仪器比对和人员比对。质量控制措施的具体实施内容如下。

（1）精密度实验。采用7平行测定，即称取7份样品进行测定分析，计算平行结果的变异系数，分析每组测定结果的精密度。共3名实验人员，每人均进行7次平行测定。

（2）加标回收实验。加标水平一般为样品含量水平的0.5～2.0倍，而20172样品的山梨酸含量水平为700～900 mg·kg-1，所以合适的加标水平为 450～1 400 mg·kg-1；取样量按2.0 g来计算，以此对应的样品加标量为0.9～2.8 mg。本实验以16 mg为实际加标量进行加标回收实验，通过测定并计算加标回收率来分析实验结果的准确性。共3名实验人员，每人均进行2次加标回收实验。

（3）质控样品实验。本次实验选用山梨酸含量与20172样品比较接近的蛋糕中的山梨酸质控样品（ZKY2930，基质：巧克力蛋糕50 g）进行测定，评估能力验证样品测定过程中的准确性。共3名实验人员，每人均进行2次质控样品实验。

（4）仪器比对和人员比对。比对实验根据实验室条件，对美国沃特世（ACQUITY ARC）以及日本岛津（Prominence UFLCXR）两种不同品牌的仪器进行比对实验，对GB/T 5009.28—2016（第一法）进行不同实验人员间的测定结果比对。运用实验人员间的比对实验，以确保实验人员、检测方法和仪器性能的可靠性。

2 结果与分析

2.1 精密度实验结果分析

称量7份20172样品按以上实验方案进行测定，结果见表1。GB/T 27404—2008要求1 000 mg·kg-1含量水平的实验室内变异系数为3.8%[18]，本次实验3组人员测定结果的变异系数都小于3.8%，均符合GB/T 27404— 2008的要求。从变异系数结果分析，无法判断各组实验人员的测定结果是否存在异常值。

表1 精密度实验结果表

2.2 加标回收与质控样品实验结果分析

称取两份20172样品，加入适量山梨酸标准储备溶液，前处理测定步骤与样品一致，计算加标回收率。称取山梨酸质控样品ZKY2930与20172样品同时进行前处理和上机测定。加标回收率与质控样品的测定结果如表2所示。由表2可知，3组人员的质控样品实验均为满意。GB/T 27404—2008要求1 000 mg·kg-1含量水平的加标回收率为95%～105%，实验人员B有一个加标回收率为92.1%，小于95%，不满足 GB/T 27404—2008的要求。加标回收率过低有可能是该次加标实验操作存在异常，也有可能是因为实验人员B的平行测定实验结果偏高，从加标回收与质控样品实验结果无法确定原始数据是否存在异常值。

表2 加标回收与质控样品实验结果表

2.3 箱线图结果分析

用Origin 2018将精密度实验原始数据看作一个整体绘制箱线图，如图2所示。由图2可知，实验人员B有一个原始数据864为离群值，故将其剔除。

图2 山梨酸原始数据箱线图

将剔除异常值后的数据再次绘制箱线图判断是否有离群值，此时已无离群值，详见图3。

图3 山梨酸处理数据箱线图

2.4 山梨酸含量的确定

剔除异常值后原始数据还有20个，假设样本数据来自正态总体，且样本量N较小（3≤N≤50），故采用Shapiro-Wilk的W统计量检验原始数据的正态性[19]，计算得到P=0.079＞0.05，不拒绝原假设，认为数据总体呈近似正态分布。由于样本数据为正态分布，故在集中趋势特征值中，选取平均值为816 mg·kg-1作为山梨酸的含量值。

2.5 山梨酸含量的评价

本次FAPAS能力验证07300共计42家实验室参与，其中有33家实验室参与了山梨酸结果统计，山梨酸含量的指定值为837 mg·kg-1，本实验室最终结果值为816 mg·kg-1，Z值为-0.4（图4，实验室代码为38）， 能力验证结果满意。

图4 FAPAS 20172中山梨酸的Z值分布柱状图

3 结论

在本次能力验证中，对20172样品的山梨酸含量测定结果为816 mg·kg-1，Z值为-0.4，结果满意。实验数据表明，对于能力验证样品山梨酸含量的测定结果，通过建立箱线图分析流程可以分析原始数据的离群情况，选取合适的集中趋势特征值确定为含量值，使结果更加准确。该方法准确、可靠，可为能力验证结果评估提供一种分析方法。