一种高产谷氨酰胺酶的米曲霉菌种的筛选 及应用的研究

◎ 滑欢欢，扈圆舒，梁 亮，伍加文，黄敏斯，陆邦炼，梁兰兰

（广东美味鲜调味食品有限公司，广东 中山 528400）

酱油是一种以大豆、小麦、麸皮等为主要原料，经过微生物发酵形成的富含营养的调味品。现有的酿造酱油工艺，包括原料蒸煮、制曲、发酵以及淋油等步骤[1]。酱油的酿造是利用米曲霉菌株分泌的不同水解酶类，将原料中的大分子物质（蛋白质、淀粉质等）分解成呈味的多肽、氨基酸、糖类、磷脂、维生素和有机酸等小分子物质，形成酱油的营养成分，使酱油具有高的营养价值，并赋予酱油独特的风味，即咸、酸、鲜、甜、苦五味调和。因此，米曲霉菌种对酱油的酿造尤为重要，是酱油酿造的基础，其性能对酱油质量和产能影响甚大[2]。

有研究表明，米曲霉在酱油生产的制曲阶段分泌的酶系种类和活力状况对酱醪发酵成熟的快慢、原料利用率的高低、成品色泽的浓淡以及味道的鲜美与否都有着直接的关系[3]。而在米曲霉生长过程中分泌的众多酶系中，谷氨酰胺酶活性的高低将直接影响到天然酿造原油中谷氨酸的含量，以及影响成品的口感鲜味，进而影响酱油产品的品质[4]。

目前，我国的酱油酿造已广泛使用纯粹培养的米曲霉，常用的米曲霉菌株主要为As3.042和As3.951。上述两种菌株是国内酱油生产厂家普遍使用的优良菌株，其能够产出丰富的蛋白酶水解酶，其中主要以中性和碱性蛋白酶为主[5]；但是这两种菌株产出的其他酶系不足，使得原料中各种成分（如蛋白质原料）不能完全被分解，因而导致酿造酱油风味不足，尤其是产出的谷氨酰胺酶不足导致鲜味不佳[6]。因此，厂家为了保证酱油产品的良好的鲜味，往往会通过额外添加谷氨酸钠等鲜味剂来提高产品品质，生产出符合消费者口味的产品。然而，随着生活水平的提高，人们日益关注健康饮食，额外添加这些鲜味剂不仅会给消费者留下不好的印象，还会使得生产成本增加，最终影响了产品的竞争力[7]。所以，通过酿造酱油过程天然获取的鲜味日益受到重视[8]。因此，设法提高米曲霉在制曲阶段的谷氨酰胺酶活力是高端酱油提高天然鲜味的重要途径。

目前，酱油的优劣通过酱油中氨基酸态氮含量来判断；氨基酸态氮含量是指以氨基酸态氮形式存在的氮元素的含量，它代表了酱油中氨基酸含量的高低。因此，当酱油的氨基酸态氮含量越高，则被认为其质量越好，风味越好。这也使得国内的酱油生产厂家大多致力于追求高氨基酸态氮含量即高氨基酸生成率的酱油，致力于提高酱油的原料利用率，而对提高酱油鲜味、甜味等风味指标的研究较少[9]。但实际上氨基酸态氮含量表示的是酱油中各种氨基酸的总含量，并不能表示某一种氨基酸的含量（如谷氨酰胺酶含量），因此氨基酸态氮含量高不代表酱油的鲜味、甜味等个别风味指标优秀。本文主要研究通过改变菌种种类来提高酱油曲中的谷氨酰胺酶活力，进而提高酱油中的谷氨酸含量，达到在原料利用率不变的基础上提高酱油的风味[10]。

此外，现有的米曲霉产孢子能力强，即产孢量较大，会对酱油生产过程产生相当大的影响，制曲过程中，在松曲和出曲时，容易出现孢子满天飞的问题而影响生产环境和工作环境。由于米曲霉孢子不溶于水，所以产孢量大的大曲吸水时间变长，即与盐水的混合时间会延长。同时成熟的大曲会产热，随着大曲与盐水混合时间的延长，增加了杂菌滋生的隐患。

本文经过诱变选育得到一株能够高产谷氨酰胺酶活力的米曲霉M01，其在保持米曲霉原有高蛋白酶活力的基础上，能够高产谷氨酰胺酶。应用该菌株酿造酱油等调味品时，能够进一步提高酱油鲜味和甜味，有效解决酱油天然鲜味不足的问题。该米曲霉产孢子能力略有所降低，既不影响制曲时米曲霉的生长，又不会产生大量孢子影响生产环境和工作环境。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿造黄豆酱生产原料：黄豆、面粉、食盐从市场采购；米曲霉菌种：米曲霉As3.951，由广东美味鲜调味食品有限公司提供；试剂：干酪素、磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸镁和琼脂粉等从市场购买。

1.2 仪器与设备

超净工作台、培养箱、种曲机、NK式旋转蒸煮锅、发酵池、60 m³发酵罐等。

1.3 试验方法

1.3.1 米曲霉菌株诱变

取As3.951菌株的成熟斜面孢子制成孢子悬液，并对孢子悬液进行常压室温等离子体诱变（Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP）。用0.85%的无菌生理盐水将诱变后的孢子悬液逐级稀释到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6浓度，制成孢子稀释液；取0.2 mL孢子稀释液涂布于酪蛋白平板培养基上，31 ℃避光培养96 h，培养过程中观察并记录菌落的菌丝生长和产孢情况、透明圈形成的快慢及透明圈大小等；挑取与出发菌株As3.951相比具有菌丝生长正常、透明圈大、产孢时间延迟特点的菌落；将挑选出的目标菌落继续涂布于大豆蛋白平板培养基上，31 ℃培养60 h，挑取与出发菌株As3.951相比有菌落直径大、菌丝生长正常的菌落。

1.3.2 诱变后菌株的初筛和复筛

（1）初筛方法。将突变菌株由豆汁斜面活化后转接三角瓶培养，观察生长情况，挑选其中菌丝生长旺盛和孢子着生正常的突变菌株，并采用常规方法检测成曲的发芽率和孢子数。

（2）复筛方法。对初筛获得的10株形状优良的米曲霉菌株，以出发菌株为对照菌株，进行小试制曲和生产发酵筛选。

1.3.3 米曲霉M01菌株遗传稳定性检测

诱变获得选育菌株高产谷氨酰胺酶活的传代稳定性是关系菌种质量的重要考察指标。现将选育获得的诱变菌株米曲霉M01进行传代，在高、中、低3个温度进行了培养温度与水解圈相关试验，对第0～10代的菌种按照常规方法进行三角瓶培养、制曲和发酵，并分析孢子数、酶活力、氨基酸态氮等指标。

1.3.4 小试规模对比米曲霉M01菌株与酱油酿造用种的产谷氨酸能力

选育获得的米曲霉M01菌株具有高产氨基酸、全氮和谷氨酸的优势，与广东美味鲜调味食品有限公司菌种库中保藏的酿造酱油用的米曲霉菌株相比较，对比不同菌株的产氨基酸、全氮和谷氨酸的能力。

1.3.5 米曲霉M01菌株在酱油酿造中的应用

以单个65 m³发酵罐为单位进行高产率游离谷氨酸米曲霉效果的验证试验，将选育到的米曲霉M01菌株和对照菌株分别制曲，成熟大曲按照一定比例进行制醪，然后发酵天然油，送检天然油的游离谷氨酸含量，并对过程中的三角瓶种、成曲和发酵天然油进行质量分析。

1.3.6 米曲霉M01菌株酿造酱油的感官鉴评

针对米曲霉M01菌株酿造得到的酱油，召集10名有丰富经验的鉴评人员进行感官鉴评，感官鉴评的评价指标包括体态、色泽、香气、鲜味、甜味、苦涩味、咸味、酸味和综合口感，分值为0～4分，分数越高，该项指标越好。

2 结果与分析

2.1 选育到菌株的复筛结果分析

根据表1和表2的结果，相对于对照菌株及其他突变菌株，菌株SY07用于制曲和发酵有更好的表现；将菌株SY07命名为米曲霉M01，并进行保藏。

如表1的结果所示，选育获得的米曲霉M01菌株具有以下特点。①生长速度与对照菌株相当，孢子量大大减少。②中性蛋白酶活和谷氨酰胺酶活力显著提高，特别是谷氨酰胺酶活力提高57%左右，预期可显著提高发酵原油的理化指标水平。

表1 菌株复筛制曲质量分析结果表

如表2的结果所示，选育获得的米曲霉M01菌株发酵指标检测结果显示，其具有高产氨基酸、全氮和谷氨酸的优势，其中谷氨酸比对照菌株高出49%；上述发酵指标有利于改善发酵原油的鲜味，使口感更加丰富，因此选育获得的米曲霉M01菌株相对于对照菌株具有明显优势。

表2 菌株复筛发酵质量分析结果表

2.2 米曲霉M01菌株遗传稳定性检测

如表3和表4所示，通过10代传代试验分析了米曲霉M01菌株在28 ℃、32 ℃、36 ℃ 3个温度下的稳定性，菌落直径和K值的结果显示，米曲霉M01菌株在菌落形态和蛋白酶分泌方面表现出了良好的稳定性，符合生产使用需求。在该菌株传代试验中，由每代菌种制作三角瓶种、制得的大曲及发酵天然油的质量分析结果可知，该菌株酿造酱油的发酵能力稳定，适合生产需要。

表3 米曲霉M01在不同温度条件下在酪蛋白培养基上传代稳定性分析表

表4 米曲霉M01传代稳定性的三角瓶种、成曲和发酵天然油质量分析表

2.3 小试规模对比米曲霉M01菌株与酱油酿造用种的产谷氨酸能力

由表5可知，选出广东美味鲜调味食品有限公司菌种库中产谷氨酸能力较高的酱油酿造用菌株，与选育得到的米曲霉M01比较大曲的谷氨酰胺酶活力和产谷氨酸能力。结果表明，选育出的米曲霉M01菌株产谷氨酰胺酶的能力远远高于其他菌株，产谷氨酸和氨基酸态氮能力也高于其他菌株。

表5 不同菌株理化指标对比表

2.4 米曲霉M01菌株在酱油酿造中的应用

如表6和表7的结果所示，米曲霉M01的产孢能力和孢子发芽能力与对照菌株相当，而产中性蛋白酶和酸性蛋白酶能力则有所提高，谷氨酰胺酶活力显著高于对照菌株，谷氨酰胺酶活力相对提升约60%；采用该菌株酿造的天然油，氨基酸态氮及原料利用率均有所提高，分别提高约22%和14%，谷氨酸含量也显著提高，提高约80%。因此，选育获得的米曲霉M01菌株发酵生产的原油鲜味更好。

表6 选育菌株酿造大曲谷氨酰胺酶活力及水黄游离谷氨酸表

表7 米曲霉M01和对照菌株的三角瓶种、成曲和发酵天然油质量分析表

2.5 米曲霉M01菌株酿造酱油的感官鉴评

表8感官鉴评结果显示，米曲霉M01菌株发酵的酱油的鲜味、甜味尤为突出，明显优于对照菌株，突出的鲜、甜味对咸味、苦涩味具有一定的掩盖作用，所以米曲霉M01菌株发酵的酱油的咸、酸、鲜、甜、苦五味更为调和，综合口感也更具有优势。

表8 选育菌株米曲霉M01发酵酱油感官鉴评结果表（单位：分）

3 结论

本文以米曲霉As3.951为出发菌株，采用ARTP诱变方法对出发菌株进行诱变获得突变菌落，交叉使用酪蛋白平板培养基和豆汁平板培养基对突变菌落进行筛选，得到米曲霉菌株M01。采用米曲霉M01为主力菌种酿造的原油的谷氨酸含量、氨基酸态氮含量均有显著提高，发酵得到的原油鲜味、甜味突出，无需后期添加鲜味剂来增加酱油鲜味，具有重要的经济意义；而且米曲霉M01还提高了原料利用率，提高了酱油的氨基酸含量。