沉默信息调节因子5对肺癌细胞生物学特征影响及相关机制

陈联 陈学诚

(1福建医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科，福建 福州 350005；2福州中德骨科医院综合内科)

老年人是肺癌的高发群体，发病隐匿且恶性程度高，目前仍存在手术复发率高、5年生存率低等问题，探寻新的治疗靶点对改善患者预后具有积极作用〔1〕。去乙酰化作用参与了真核基因组的表达调控，组蛋白乙酰化和去乙酰化修饰在其中发挥重要作用〔2〕。沉默信息调节因子相关酶类是一系列依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、核心区高保守的组蛋白去乙酰化酶〔3〕。人体沉默信息调节因子家族有7个亚型，其中沉默信息调节因子5位于线粒体基质〔4〕。研究者发现，沉默信息调节因子5缺乏会抑制三磷酸腺苷(ATP)生成，同时能够激活小鼠心脏组织中的腺苷一磷酸(AMP)活化的蛋白激酶〔5〕。沉默信息调节因子5失活能够抑制丝氨酸分解代谢，抑制肺癌肿瘤生长〔6〕。但目前关于沉默信息调节因子5在肺癌中作用及相关机制的研究仍十分少见。本研究探讨沉默信息调节因子5对肺癌细胞生物学特征的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 人肺癌细胞NCI-H838、人正常肺上皮细胞BEAS-2B均购于上海奥陆生物科技有限公司；RPMI1640培养基、胎牛血清购于沃卡威(北京)生物有限公司；空载体病毒、重组人沉默信息调节因子5购于美国BioVision公司；Stat3激动剂大脑通透性的神经保护肽(Colivelin)购于美国TargetMol公司；CCK-8试剂盒、Transwell小室、Matrigel基底胶均购于北京沃比森科技有限公司；总RNA提取试剂盒(Trizol法)购于上海杰美基因医药科技有限公司；兔抗人沉默信息调节因子5、Stat3、p-Stat3单克隆抗体，鼠抗人Nanog单克隆抗体购于奥维亚生物技术有限公司。

1.2细胞培养与分组 使用含10%胎牛血清、链霉素100 μg/ml、青霉素50 IU/ml的RPMI1640培养基，37℃ 5%CO2的培养箱中孵育，每24～48 h换液，观察细胞汇合超过80%时消化传代。实验分组如下：空白对照组(常规培养基)；空载体转染组(常规培养基+空载体病毒)；沉默信息调节因子5过表达组(常规培养基+重组人沉默信息调节因子5病毒)；Colivelin组(常规培养基+重组人沉默信息调节因子5病毒+0.5 μmol/L Colivelin)；取对数生长期细胞用于实验。

1.3反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测沉默信息调节因子5 mRNA表达 总RNA提取试剂盒收集人肺癌细胞NCI-H838、人正常肺上皮细胞BEAS-2B及空白对照组、空载体转染组、沉默信息调节因子5过表达组肺癌细胞的总RNA，逆转录得到cDNA。PCR扩增引物由上海为青生物工程有限公司合成。沉默信息调节因子5上游引物：5′-CTCATGTAGTGGTCGTCGTAG-3′，下游：5′-CCGTCATTAGGCGGT-CGGAAC-3′。β-actin上游引物：5′-CTTGTAACGG-GTCGTGATGCC-3′，下游：5′-AAAGTCCCCTCTTTAAACCGA-3′。PCR体系15 μl，包括dNTP Master Mix 5 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、模板DNA 4 μl、双蒸馏水4 μl。扩增条件：94℃预变性2 min，95℃变性30 s，50℃复性40 s，共40个循环，72℃延伸2 min。以参照基因β-actin为标准进行相对定量。

1.4CCK-8检测细胞增殖能力 将4组细胞按1×105/ml密度铺于96孔板中，每孔细胞培养基100 μl，放入37℃ CO2培养箱中孵育24 h，取出后每孔加入浓度10%的CCK-8试剂100 μl，继续培养2 h，上酶标仪读取450 nm处的吸光度值反映细胞增殖能力。

1.5划痕实验检测细胞迁移能力 将肺癌细胞按1×105/ml密度铺于6孔板中，光学显微镜下观察细胞生长融合度达到90%时，使用移液枪头进行垂直划痕，根据分组向培养孔中加入对应的干预药物，设3个复孔。放入37℃ CO2培养箱中孵育24 h，光学显微镜下观察划痕宽度变化并拍照，测量细胞划痕面积，计算划痕愈合率(%)=(孵育前划痕面积-孵育24 h后划痕面积)/孵育前划痕面积×100%。

1.6Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力 Matrigel基底胶与RPMI1640培养基按1∶9的比例稀释，向Transwell上室中加入50 μl，放入37℃ CO2培养箱中孵育4 h，将肺癌细胞按1×105/ml密度加入上室100 μl；向Transwell下室加入对应的干预药物，放入37℃ CO2培养箱中继续孵育24 h，结晶紫染色，光学显微镜下计数进入下室的细胞数量。

1.7Western印迹检测沉默信息调节因子5及Stat3/Nanog信号通路蛋白表达 RIPA细胞裂解液提取人肺癌细胞NCI-H838、人正常肺上皮细胞BEAS-2B及4组肺癌细胞的总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白浓度，行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转法将电泳得到的目标蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，使用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温下封闭1 h，滴加一抗：兔抗人沉默信息调节因子5、Stat3、p-Stat3单克隆抗体，鼠抗人Nanog单克隆抗体；4℃孵培育过夜。之后滴加二抗：山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG，室温下孵育1 h，电化学发光(ECL)显影，使用Image J软件读取各条带的灰度值。

1.8统计学方法 采用SPSS24.0统计学软件进行方差分析和t检验。

2 结 果

2.1沉默信息调节因子5在人正常肺上皮细胞和肺癌细胞中的表达 肺癌细胞NCI-H838中沉默信息调节因子5 mRNA(0.35±0.11)、蛋白表达水平(0.31±0.09)明显低于人正常肺上皮细胞BEAS-2B(0.92±0.05、0.88±0.07；t=21.965、19.208，均P=0.000)。

2.2过表达沉默信息调节因子5验证实验 沉默信息调节因子5过表达组肺癌细胞NCI-H838中沉默信息调节因子5 mRNA、蛋白表达水平高于空载体转染组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，提示沉默信息调节因子5转染成功。见图1、表1。

2.3各组肺癌细胞增殖能力比较 沉默信息调节因子5过表达组细胞增殖(0.39±0.12)明显低于空白对照组(0.75±0.07)和空载体转染组(0.78±0.09；t=14.859、15.307，P=0.001、0.000)；Colivelin组细胞增殖(0.56±0.10)明显高于沉默信息调节因子5过表达组(t=8.551，P=0.018)；细胞增殖能力在空载体转染组与空白对照组之间差异无统计学意义(t=0.169，P=0.905)。

2.4各组肺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力比较 沉默信息调节因子5过表达组细胞迁移和侵袭能力明显低于空载体转染组和空白对照组(P<0.01)；Colivelin组细胞迁移、侵袭能力明显高于沉默信息调节因子5过表达组(P<0.05)；细胞迁移、侵袭能力在空载体转染组与空白对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.5各组肺癌细胞Stat3/Nanog信号通路相关蛋白表达分析 沉默信息调节因子5过表达组肺癌细胞中p-Stat3、Nanog蛋白表达水平明显低于空白对照组和空载体转染组(P<0.05)；Colivelin组肺癌细胞中p-Stat3、Nanog蛋白表达水平明显高于沉默信息调节因子5过表达组(P<0.05)。Stat3蛋白表达水平在各组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1、图2。

3 讨 论

沉默调节蛋白是一类具有多种代谢调节酶活性的蛋白家族，最初研究认为是遗传沉默因子，后来研究发现沉默调节蛋白在延长酵母寿命方面作用明显。但目前关于沉默调节蛋白在肿瘤发生、发展中的作用仍未完全明确。相关研究显示，沉默信息调节因子6在肺癌组织中高表达，且能促进肺癌细胞生长，当其表达缺失时会使肺癌细胞周期停留在G1〔7〕；沉默信息调节因子2在结直肠癌中发挥抑癌的作用〔8〕。沉默信息调节因子5定位于线粒体，无法参与赖氨酸去乙酰化过程，但具有烟酰胺二核糖核苷依赖的丙二酰化酶活性〔9〕。当蛋白质及相关信号通路琥珀酰基化时，部分代谢信号通路被破坏，表现为肝脏组织中的酮体分泌量减少和脂肪酸累积量下降〔10〕。沉默信息调节因子5参与肺癌、神经胶质瘤的发生与发展过程。人肺癌细胞中沉默信息调节因子5能够将糖酵解的限速酶M2型丙酮酸激酶去琥珀酰化〔11〕；沉默信息调节因子5缺失的细胞中，当限速酶M2型丙酮酸激酶琥珀酰水平增加时，抑制了丙酮酸激酶活性，下调沉默信息调节因子5表达，造成肺癌细胞增殖能力下降〔12〕。非小细胞肺癌患者中沉默信息调节因子5高表达与不良预后密切相关〔13〕。沉默信息调节因子5能够靶向作用于细胞抗氧化过程中的主要转录调控因子核因子E2相关因子2，敲除后能够抑制非小细胞肺癌细胞的生长〔14〕。沉默信息调节因子5表达上调能够抑制异柠檬酸脱氢酶的超琥珀酰化，抑制神经胶质瘤的增殖〔15〕。但沉默信息调节因子5在肺癌中的作用及相关机制仍未明确。

本研究结果说明，人肺癌细胞中沉默信息调节因子5低表达可能与肺癌细胞活性有关。沉默信息调节因子5表达上调能够有效抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，有利于抑制肺癌的发生与发展。白细胞介素6/Stat3是非小细胞肺癌细胞癌干细胞增殖与更新的关键通路。相关研究显示，人肺癌细胞中沉默信息调节因子5去乙酰化Stat3，进而抑制线粒体丙酮酸代谢中Stat3的作用〔16〕。本研究结果提示，Stat3/Nanog信号通路参与调节沉默信息调节因子5介导的肺癌细胞增殖、迁移和侵袭。Nanog参与调节干细胞增殖，在维持胚胎干细胞的亚全能性方面发挥重要作用，可独立于LIF/LIFR/ Stat3通路维持早期发育胚胎中的内细胞团、胚胎干细胞亚全能性，受到了肿瘤研究领域的广泛关注〔17〕。本研究结果提示，默信息调节因子5可能通过调节肺癌细胞的更新和增殖来调节肺癌的发生与发展。

综上，沉默信息调节因子5在肺癌细胞中低表达，上调沉默信息调节因子5表达后能够明显抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，上述作用可能与抑制Stat3/Nanog信号通路有关；沉默信息调节因子5有望成为肺癌治疗的新靶点。