牛磺去氧胆酸影响2型糖尿病小鼠主动脉僵硬度和内皮功能障碍的机制

陈燕芳 张建锋 刘浩飞

(1郑州澍青医学高等专科学校临床医学系内儿教研室，河南 郑州 450064；2河南中医药大学第一附属医院肾病科)

2型糖尿病(T2DM)的患病率持续增长，且经常诱发或者伴发心血管疾病(CVD)〔1～3〕。与T2DM和CVD相关的关键事件之一是血管功能障碍的发展，特别是导致T2DM相关CVD的血管功能障碍的两个组成部分：动脉僵硬和内皮功能障碍〔4～6〕，因此探究其机制成为目前的研究热点。内质网是代谢的重要调节器。内质网内的功能障碍，广义上称为内质网应激，导致未折叠蛋白反应(UPR)，这是一种旨在恢复内质网稳态的适应性途径〔7〕。尽管UPR是抵抗内质网应激的防线，但UPR有可能在持续刺激中慢性激活，继而诱发细胞功能障碍〔8,9〕。牛磺去氧胆酸(TDCA)已被证明可以缓解与内质网应激相关的心脏代谢疾病〔10,11〕。然而，很少有研究探讨内质网应激在糖尿病内皮功能障碍中的作用，本研究探讨TDCA对T2DM小鼠内皮功能障碍和动脉僵硬度的影响。

1 资料与方法

1.1研究对象和分组干预 选取30只体重23～25 g的健康雄性SPF级C57BL/6J小鼠随机平均分为空白对照(CON)组、模型(MD)组和TDCA干预(MD+TDCA)组。3组小鼠均饲养在SPF级实验动物房，光照时间为12 h，温度为(25±5)℃，相对湿度为50%～60%，每天正常进食饮水，自由活动。每组小鼠具体干预方法为：(1)CON组用普通饲料喂养。(2)MD组构建T2DM小鼠模型，用高热量饲料喂养小鼠4 w后，静脉注射浓度为1%的链脲佐菌素30 mg/kg溶液(该溶液用0.1 mol/L、pH=4.2的柠檬酸盐缓冲液配制而成)，在用药时间达到1 w后取空腹小鼠尾部血液测空腹血糖水平，当空腹血糖≥16.7 mmol/L时则判断为造模成功。在建模过程中，CON组小鼠则通过尾部静脉注射等量的链脉佐菌素溶液。(3)MD+TDCA组中T2DM小鼠模型构建方法同MD组，在链脲佐菌素用药1 w后经腹腔注射TDCA，剂量为250 mg/(kg·d)，连续注射4 w，待小鼠长至6个月时通过心脏穿刺抽血法将其致死。

1.2观察指标

1.2.1标本的制备 首先配制pH=7.4的冰冻生理盐水〔含0.185 g乙二胺四乙酸(EDTA)〕备用。在小鼠断头台处用异氟烷将所有小鼠麻醉，通过心脏穿刺抽血法将其致死，液氮速冻。其中颈动脉和二级肠系膜动脉均需要在配制好的冰冻生理盐水中完成切除。

1.2.2血清生化指标 各组小鼠均在喂养4 w后称量体重，然后取尾部静脉血液，用放射免疫法测定血清胰岛素水平；通过生化分析仪测定空腹血糖水平；胰岛素抵抗指数(ISI)计算公式为：ISI=In〔1/(空腹血糖×空腹血清胰岛素)〕。

1.2.3主动脉僵硬度 使用脉搏分析系统分析主动脉僵硬程度，指标包括主动脉脉搏波速度(aPWV)、主动脉膨胀度和主动脉脉搏波增强指数。具体操作步骤如下：用浓度为2%的异氟烷将小鼠麻醉后将其仰卧置于加热板上，用心电图电极将小鼠腿部完全固定，随时监测小鼠的心率处于450次/min左右，并根据心率大小调整异氟烷浓度。采用多普勒探针完成上述各指标的测定，其中aPWV=探头间距离(cm)/时间差(胸部和腹部预注射间，s)。

1.2.4血管内皮功能 根据每条动脉的最大管腔直径计算扩张百分比，指标包括肱动脉内皮依赖性舒张功能(EDD)和肱动脉非内皮依赖性舒张功能(EID)。

1.2.5实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR) Trizol(Life Technologies公司，美国)分离主动脉和PVAT RNA。用iScript(Bio-Rad,Hercules公司，美国)从0.25 μg/μl RNA中合成cDNA，反应20 μl。使用icycle和iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad,Hercules公司，美国)进行两步扩增(95℃ 10 s，60℃退火30 s)，共40个循环。采用数据归一化法计算mRNA相关基因的表达水平，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)上游引物：5′-CGGTCGCTTCAGTCGTCAG-3′，下游：5′-ATGTTCGGCTTCCCATTCTCC-3′；GAPDH上游引物：5′-ACAGTCGAGATGGGATACCCTTACCATTACT-3′，下游：5′-CTGCTGACGTCGAGTGGGC-AA-3′。

1.2.6eNOS蛋白表达水平测定 从小鼠主动脉中提取总蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法测定eNOS蛋白表达水平，取30 μg蛋白置于聚丙烯酰胺凝胶上完成电泳实验，然后经过电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在常温下将封闭1 h，然后在4℃的(1∶200)一抗中培养过夜。用TRIS-BU在盐水中清洗0.1%的Twin-20，与二级抗体(1∶500)在室温下孵育1 h，然后通过成像仪检测光密度，通过Western印迹对比分析各条带的灰度值，分析eNOS蛋白表达水平。

1.3统计学处理 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组胸主动脉形态学 CON组主动脉组织完整且内膜光滑，不存在缺损的现象，并且中膜层的平滑肌细胞排列有序，染色后显而易见，不存在增生的现象。与CON组相比，MD组主动脉组织受损严重，尤其是内膜更为显著，内皮细胞体积增大，中膜层的平滑肌细胞排列无序。MD+TDCA组主动脉组织的各层细胞的排列较MD组整齐，且组织受损情况得到了有效缓解。见图1。

2.2各组体重、空腹血糖、空腹血清胰岛素水平和ISI测定 CON组体重和ISI值高于MD组，空腹血糖和空腹血清胰岛素则低于MD组，差异有统计学意义(P<0.05)。而MD+TDCA组与CON组比较，体重及空腹血清胰岛素水平无统计学差异(P>0.05)，空腹血糖升高、ISI降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3各组反映主动脉僵硬度指标比较 CON组主动脉脉搏波增强指数和aPWV介于MD组和MD+TDCA组之间，主动脉膨胀度则显著低于MD组和MD+TDCA组，差异均有统计学意义(P<0.05)。MD组主动脉膨胀度、主动脉搏动增强指数和aPWV均高于MD+TDCA组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.4各组血管内皮功能评估结果 CON组EDD〔(23.23±2.41)%〕小于MD组〔(35.12±2.13)%〕和MD+TDCA组〔(26.61±3.04)%〕，EID〔(26.42±7.11)%〕高于MD组〔(22.69±3.32)%〕和MD+TDCA组〔(23.35±6.60)%〕，差异均有统计学意义(P<0.05)。而MD组EDD显著高于MD+TDCA组，EID显著低于MD+TDCA组(P<0.05)。

2.5实时荧光定量-PCR CON组的eNOS mRNA表达水平(1.15±0.22)显著高于MD组(0.53±0.05)和MD+TDCA组(1.01±0.03，P<0.05)。MD组eNOS mRNA 表达水平显著低于MD+TDCA组(P<0.05)。见图2。

2.6Western印迹检测eNOS蛋白水平 CON组eNOS蛋白表达水平(1.02±0.16)显著高于MD组(0.53±0.06)和MD+TDCA组(0.92±0.20，P<0.05)。MD组eNOS蛋白水平显著低于MD+TDCA组(P<0.05)。见图3。

3 讨 论

有报道表明，内质网应激可能是T2DM相关血管功能障碍的治疗靶点，内质网应激已经成为肥胖和T2DM模型中代谢紊乱的新中介〔12～14〕。本研究结果显示，相对于MD组主动脉组织及内膜受损较为严重，MD+TDCA组的主动脉组织受损情况已获得有效缓解。有研究也报道了内质网应激与TDCA之间的关系〔15～17〕，原因主要考虑是与TDCA的应用产生了较好的干预效果有关〔18～20〕。TDCA可较好地对内质网应激反应产生一定的抑制效果，其主要可能是通过对于T2DM小鼠机体内的微炎症反应及胰岛素相关信号通路的关键蛋白进行活化影响而发挥作用〔21～23〕。同时，其优化了小鼠机体的胰岛素抵抗状态，并对血管内皮产生较好的改善作用，因此MD+TDCA组的主动脉组织及内膜均获得了较好的修复缓解〔24～26〕。有报道证实，高脂饮食诱导的内皮功能障碍和主动脉内质网应激均可被TDCA给药逆转〔27～29〕。同时，本研究结果表明，MD+TDCA组的血糖控制水平及胰岛素抵抗状态得到明显优化，且主动脉僵硬度及血管内皮功能亦获得了较好的缓解。究其原因，TDCA可有效抑制T2DM小鼠机体肝脏及脂肪组织中的内质网应激，并能改善其机体内的葡萄糖耐受〔30～32〕。同时，TDCA能减少高胰岛素血症的发生概率，强化机体针对胰岛素产生的敏感性，进而优化机体内的胰岛素抵抗状态，并能够抑制c-Jun氨基末端激酶等相关炎症激酶的活化，从而使血管内皮功能得到明显地改善〔33～35〕。T2DM模型小鼠的内皮细胞和平滑肌细胞存在广泛的血管功能障碍，而TDCA可降低T2DM模型小鼠的动脉僵硬度，这与本文的研究结论基本相符。此外，Dell′Aglio等〔36〕、Ni等〔37〕也有类似的报道可加以佐证。

综上，内质网应激可能是T2DM相关血管功能障碍的新原因和治疗靶点，TDCA对T2DM小鼠的主动脉僵硬度及内皮功能障碍具有较好的改善效果。